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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » pENTR/D/TOPO连接失败
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qwqwqwqwq

新虫 (初入文坛)

[求助] pENTR/D/TOPO连接失败已有1人参与

最近在用pENTR/D/TOPO，我的pcr片段从1kb到2kb不等，尝试过不同的pcr产物与vector的摩尔比，一般都是室温反应过夜，做了几个基因，有的基因一个菌落都不长，有的长了几个，但都不会超过10个。请问大神是什么原因啊。我的体系一般都是0.5微升vector+0.5微升盐+pcr和水，总共3微升体系。
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1楼2018-01-08 00:10:05
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qwqwqwqwq

新虫 (初入文坛)
大神们，求帮助啊
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2楼2018-01-16 20:59:41
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

我pENTR/D/TOPO的经验是，kit一定要新。冻融几次后活性就低了。
还有37˚C的恢复的时间可是稍长一点，比如一个半小时
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-17 05:23:31
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qwqwqwqwq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-17 05:23:31
我pENTR/D/TOPO的经验是，kit一定要新。冻融几次后活性就低了。
还有37˚C的恢复的时间可是稍长一点，比如一个半小时

新kit和旧的都用过，都不行，转化不成功的还是一直转化不成功。
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4楼2018-01-17 20:37:58
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by qwqwqwqwq at 2018-01-17 20:37:58
新kit和旧的都用过，都不行，转化不成功的还是一直转化不成功。...

引物设计？5‘加CACC了吗？
必须用高保真酶。
纯化一下
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
5楼2018-01-18 23:33:28
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qwqwqwqwq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-18 23:33:28
引物设计？5‘加CACC了吗？
必须用高保真酶。
纯化一下...

加cacc了 用的phusion-HF的 每次都是gel purify
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6楼2018-01-19 07:18:44
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102625015

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qwqwqwqwq at 2018-01-19 07:18:44
加cacc了 用的phusion-HF的 每次都是gel purify...

楼主你好，请问这个问题你解决了吗？求分享经验。我也在用pENTR/D/TOPO， 遇到同样的问题。 我也用的Phusion High-Fidelity做PCR。长出来十来个菌落，全是假阳，联系客服技术支持，他们分析说PCR片断没进去，长出来的是背景菌落，是没线性化成功的pENTR/D/TOPO。求各位高人指教，谢谢。
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7楼2018-10-31 14:07:12
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