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RT-PCR 条件摸索
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我最近在做半定量RT-PCR分析,在园子里面也读了不少帖子，知道半定量RT-PCR分析需要摸索很多条件，比如循环数，Mg2+浓度，退火温度等，但到自己的实验还是有一点迷糊不清，还请有经验的战友能给予悉心指导，在此非常感谢！ 我的样本分了2个组,一个对照组,一个干预组。对照组和干预组内都有三个时间段，一个是12小时，一个是36小时,还有一个72小时。内参为16s 和三个目的基因. 我的目的是看这三个基因在两个不同处理组的不同时间点的基因表达差异，只需要知道大致的趋势即可，另外由于实验室没有实时定量RT-PCR设备，所以只能进行半定量看看大概的趋势。 进行半定量RT-PCR分析需要摸索PCR扩增的循环数,不同基因需要不同的循环数,尽量保证所有基因都在指数期,我不太明白的地方是: 1) 2个样品组的三个时间点的样品共6个总RNA样品,取相同的量(3ug/20ul体系)进行反转录后，然后取1ul进行PCR扩增，我需要针对每个RNA样品分别摸索内参和目的基因的循环数吗？怎么来决定他们各自的循环数（比如说指数期的循环数有20，22，25都可以在电泳上看见，到底选哪个呢？），如果同一个基因在三个时间点选取的循环数不一样，是不是就没有办法比较了，是不是不应该这么去理解？或者说到底怎么来比较三个目的基因的表达差异？ 2) 条件摸索好之后，那么我是不是把每组扩增的内参基因都调节到一个亮度，将所有的内参基因的值都设定为1，然后目的基因的亮度值和它比较，最后比较的是该比值在不同处理组和不同时间点之间的大小？是这样的吗？ 关于基因扩增摸索部分我还是不清楚到底该怎么做，请有经验的战友详细指导一下，本人不胜感激，谢谢 [ Last edited by 350784478 on 2009-10-17 at 17:07 ] |
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