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聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 PCR 实验步骤如下： PCR 反应试剂 DNA 模板 与特定 DNA 模板结合的引物 去离子水 商业化的 DNA 聚合酶以及缓冲液 dNTP MgSO4（可选） DMSO（可选） PCR 反应准备工作 PCR 反应开始前，你需要准备好 DNA 模板（基因组 DNA 或者反转录制备的 cDNA）, 特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化 DNA 聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。 DNA 聚合酶的选择 市面上有多种 DNA 聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将 DNA 聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的 Taq 聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的 PCR 产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的 Taq 聚合酶已经足够。 另外要注意的一点是，进行 T 载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有 A 末端的，因此你在 T 载体连接之前需要进行加 A 反应。或者直接选用普通的 Taq 聚合酶。 引物引物特异性会影响到 PCR 反应成功的可能性，好的引物设计对 PCR 成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑： 1.引物长度。通常 PCR 引物长度在 18~22 个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。 2.解链温度 （Tm）。Tm 值的定义是使得一半双链 DNA 解螺旋成为单链 DNA 的温度。引物的 Tm 值通常要在 52~58 ℃ 之间。 3.GC 含量。最适合的 GC 含量为 40~60%。 就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如 primer 5 和 Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。 PCR 操作流程 PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。 准备好各种试剂和 PCR 仪，就可以开始 PCR 实验：将各种试剂混合并按照说明书设置 PCR 反应。一般 PCR 循环如下： 1.起始步骤：这对于热启动 PCR 而言是必须的，将反应混合液加热至 94~98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶。这一步的时间取决于所选用的 DNA 聚合酶。 2.变性步骤：DNA 本身是双链结构，而 DNA 扩增需要引物与单链 DNA 模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链 DNA。这是 PCR 循环中的第一步。 3.退火步骤：变性之后，DNA 模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与 DNA 模板互补，当反应温度降至 50~65 ℃ 时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的 Tm 值，通常比引物 Tm 值低 3～5 ℃。这一步通常维持 20～40 秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始 DNA 合成。 4.延伸步骤：在这一步，DNA 聚合酶开始 DNA 合成，因此这一步的温度选取的是 DNA 聚合酶的最优温度。通常我们选用 72 ℃，但某些 DNA 聚合酶的最适温度是 68 ℃。这一步与体内的 DNA 复制很相似：DNA 聚合酶按照碱基互补规律将 dNTPs 加到引物的 3’ 末端最终得到新的 DNA 双链片段。延伸时间取决于目的 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的合成能力。一般而言 DNA 聚合酶每 60 秒能够合成 1 kb 长度的 DNA。 5.循环：第 2 步至第 4 步称为一个循环。每次循环之后 DNA 的量均是前一次的两倍。通常一次 PCR 反应进行 30~35 个循环。在前几轮的 PCR 循环过程中 PCR 产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dNTPs 和引物的量的减少以及 DNA 聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此 PCR 反应的产量也受到了限制。 6.最后的延伸步骤：当 30~35 个循环结束后，我们通常会以 68~74 ℃ 延伸 5~10 分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 DNA 全部反应完毕。 7.保存温度：通常我们设置 4~10 ℃ 为反应后 PCR 产物的保存温度。 每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。 反应最终的 DNA 扩增量可用 Y=(1+X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现「停滞效应」，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。 PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’ 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的。 以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3’ 端开始延伸，其 5’ 端是固定的，3’ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是「长产物片段」。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即「长产物片段」) 结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5’ 端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3’ 端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的「短产物片段」。 不难看出「短产物片段」是按指数倍数增加，而「长产物片段」则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。 PCR 常见问题原因及对策 无扩增条带 1.酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 2.模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。 3.变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。 4.反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95 ℃ 加热 5~10 分钟。 5.引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。 6.引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。 7.DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。 PCR 产物量过少 1.退火温度不合适。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。 2.DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。 3.PCR 循环数不足。增加反应循环数。 4.引物量不足。增加体系中引物含量。 5.延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。 6.变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。 7.DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。 扩增产物在凝胶呈弥散状 1.酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 2.dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。 3.MgCl2 浓度过高。可适当降低其用量。 4.模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。 5.引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。 6.循环次数过多。增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用两种温度的 PCR 循环。 7.退火温度过低。 8.电泳体系有问题： ① 凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； ② 凝胶没有凝固好； ③琼脂糖质量差。 9.若为 PCR 试剂盒则可能： ① 由于运输储存不当引起试剂盒失效； ②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。 10.降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 扩增产物出现多条带（杂带） 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。 5.样品处理不当。 6.Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。 7.若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。 8.复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。 9.反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。 10.引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。 11.引物量过多。减少反应体系中引物的用量。 12.模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。 13.外源 DNA 污染。确保操作的洁净。 阴性对照出现条带 试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。 条带大小与理论不符 1.污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。 2.模板或引物使用错误。更换引物和模板。 3.基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。 |
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