| 查看: 727 | 回复: 5 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
5金币求助：大肠杆菌中全蛋白的提取方法。急需！
|
|||
|
求助各位虫友：大肠杆菌中全蛋白的提取方法，同时保证要除去其中的DNA和RNA，因为本人所需的全蛋白的作用底物为DNA小片段。本人急需，能否稍微详细点，非常感谢各位虫友的帮助！ [ Last edited by 松竹 on 2009-3-1 at 10:41 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
0854复试调剂 276
已经有5人回复
-
欢迎采矿、地质、岩土、计算机、人工智能等专业的同学报考
已经有6人回复
-
0857调剂
已经有5人回复
-
279求调剂
已经有4人回复
-
284求调剂
已经有8人回复
-
材料复试调剂
已经有4人回复
-
本子写完了，给DS兄弟看了，得了92分
已经有7人回复
-
求调剂
已经有6人回复
-
材料学硕318求调剂
已经有13人回复
-
一志愿郑大材料学硕298分，求调剂
已经有5人回复
张力民1598
铜虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 1160.7
- 红花: 2
- 帖子: 246
- 在线: 33.4小时
- 虫号: 664421
- 注册: 2008-11-29
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2009-03-01 09:39:47
张力民1598
铜虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 1160.7
- 红花: 2
- 帖子: 246
- 在线: 33.4小时
- 虫号: 664421
- 注册: 2008-11-29
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2009-03-01 09:41:32
cauzhangtao
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 4438.5
- 散金: 13
- 红花: 3
- 帖子: 693
- 在线: 129.2小时
- 虫号: 547332
- 注册: 2008-04-17
- 性别: GG
- 专业: 分子与进化生态学
4楼2009-03-01 09:59:10
5楼2009-03-02 06:42:05
★
松竹(金币+1,VIP+0):很有用，我还想问你下，这两种方法是否都会使蛋白质变性？我提的蛋白要有活性才行。非常谢谢！ 3-4 11:12
松竹(金币+1,VIP+0):很有用，我还想问你下，这两种方法是否都会使蛋白质变性？我提的蛋白要有活性才行。非常谢谢！ 3-4 11:12
|
一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。 2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。 4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol裂解液中分离总蛋白 1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。 2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。 3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。 4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min， 2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。 6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 不知道这个对你是否有用！！！！！！！ |
6楼2009-03-04 09:27:22
10