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重组蛋白表达系统概述https://mp.weixin.qq.com/s?__biz ... 2ab88f188c4c7599#rd 蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成： 1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、动物细胞，植物反应器、动物反应器等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。 2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。 3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。 大肠杆菌表达系统 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。 优点：表达水平高，低成本，易培养和大规模工业生产，生产迅速培养周期短，转化操作简单，蛋白表达量高且可以通过多个参数进行优化，容易形成二硫键。 缺点：蛋白折叠性较差（包括细菌蛋白），易形成包涵体，与真核生物不同密码子体系，真核蛋白表达后很少的翻译后修饰，分泌大量内毒素。 酿酒酵母 不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，酿酒酵母一般不用做重组蛋白质表达的宿主菌。 优点：表达水平较高，分泌蛋白或细胞表达的良好选择，易培养且培养低成本。拥有大多数真核生物的翻译后修饰，蛋白表达后有效折叠，无内毒素分泌。 缺点：比毕赤酵母的表达水平低，分泌能力可能低于毕赤酵母，糖基化与哺乳动物细胞不同。过糖基化，N-端糖基链结构具有致敏性 甲醇酵母表达系统（毕赤酵母） 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。 优点：表达水平高，易培养，生长快速，分泌蛋白或细胞内表达的良好选择，蛋白分泌高效且允许简单纯化，广泛的翻译后修饰，N-端糖基化能力优于酿酒酵母，无内毒素分泌。 缺点：使用甲醇作为诱导剂具有一定危害（甲醇有毒性），糖基化仍然不同于哺乳动物细胞。 昆虫杆状病毒表达系统 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。 优点：表达水平高（特别是细胞内蛋白），较快的生长速度，有效的蛋白折叠，广泛的翻译后修饰，糖基化与哺乳动物细胞类似，相对容易地酶促的去糖基化（对于蛋白结构测定有利），无内毒素。 缺点：培养基昂贵，需要大量的病毒。亲肽的分泌通路低效，糖基化仍然不同于哺乳动物细胞，病毒侵染会导致细胞裂解和潜在的表达蛋白降解。 哺乳动物细胞 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。 优点：较高的表达水平，可中度放大，细胞的悬浮培养特性可大规模生产，微载体培养放大培养，有效的蛋白折叠，适合分泌蛋白，充分的翻译后修饰，无内毒素。 缺点：培养基昂贵，复杂的生长条件，培养周期长，成本高。 动植物反应器 动植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用动植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。 小结 各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低，大肠杆菌系统还是被证明是最受欢迎的重组药物蛋白表达宿主，但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物细胞表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐。因此，选择表达系统时，应充分考虑各种因素，如要表达蛋白的性质、生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入，随着更多表达机理和影响因素的发现，相信在不久的将来，原核与真核两种表达系统在重组蛋白的生产研究中仍然都会占有一席之地，并将出现更多更加完善的表达系统。 |
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