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qingxiong

木虫 (正式写手)

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专业: 病原真菌学

[交流] 真菌的DNA和RNA提取方法

真菌DNA的提取（方法一）
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液，快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）
4.1000rpm，4℃，5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用
DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，
3M NaAc
TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA
酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)
氯仿:异戊醇(24:1)
异丙醇
无水乙醇
75%乙醇
RNaseA

真菌DNA的提取（方法二）
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。
DNA提取缓冲液：100 mM Tris-HCl（pH8.0）,20 mM EDTA（pH8.0）,1.5 M NaCl, 2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2% 巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入
5M KAc

方法一和二，是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样的哟！
奇怪的是鸭鸭上怎么没办法输入微升的符号！只有用ul代替了！
真菌菌丝的总RNA的提取
RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。
SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA
10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。
3M NaAc
氯仿:异戊醇（24:1）
酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）
DEPC处理水用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌
无水乙醇
70%酒精
1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。
2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。
3. 65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次
4. 加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）
5. 取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）
6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜)
7. 10,000 rpm，4℃离心20 min
8. 弃上清，用500 ulSSTE溶解沉淀
9. 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次, 氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min）
10. 加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上
11. 12,000 rpm，4℃离心20 min
12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥
13. 加200 ul的DEPC处理水溶解
14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）
注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。

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