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铜虫 (正式写手)

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[求助] 关于高通量测序后构建进化树的相关问题，有些细节不懂，希望大家帮帮忙已有1人参与

本人刚接触分子生物信息学这一块，最近刚开始学习做系统发育进化树，然后在做的过程中出现了很多的问题，现在说出来，希望做过的大神能够给一些意见和建议。
我是测的高通量测序，做功能菌AOAAOB，因为功能菌基因的注释结果不是很好，所以想要做一个系统发育的进化树，来看看自己得到的OUT到底是属于哪一个属的，我的操作就是拿代表OUT的序列在BLAST上比对，然后勾选uncultured，会得到一些有具体菌种名称的序列，只是identity没有100%，可能就是92%，94%之类的，然后QUERY COVER也是有可能不会是100%，就99%，98%，97%这样子的，就拿AOB举例子来说，我取丰度最高的前十代表OTU来按照上面的操作搜索参比序列，发现前十代表OTU的序列本身就比较相近，可能是土壤里面本身的菌落结构比较单一，最后得到了一个比较粗糙的进化树。这个树太粗糙以至于有些序列放了几遍我也开始没发现。只是举个例子而已。
现在存在的问题如下：
1.我的代表OTU序列本身就比较相近，所以在进化树里面OTU自己都聚在了一起，而已经的参比序列聚到了一起，而且尽管相似度都很高，但是自展值有的却很低，有的也就是三十几，四十几，这完全没有达到我的目的，看不出哪个OTU跟哪个菌比较近，不知道这种情况应该怎么办？怎么调整？
2.我用blast找参比序列的时候是勾选了unclutured的，就是不知道在进化树能不能放入uncultured的菌属，像我上面描述这样子的操作到底可不可行？
3.高通量序列测出来的有很多代表OTU序列，不知道是应该放丰度前1%，还是放丰度排名前30位的OTU序列？
4.一般都是会用亲缘关系比较远的序列作为根，亲缘关系比较远的序列如何找，如何确定？感觉自己找亲缘关系远的或者近的都比较盲目。
5.有的文章中会在后面加上是哪些类，比如是nitrosospira,nitrosomonas等，甚至有的是Group Ⅰ.1之类的，就像知道如果序列是uncultured，那如何知道它是属于哪个属的？
自己搞了一周了，还不解，希望各位帮帮忙

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1楼 2017-12-01 21:09:54

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新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

由于在微生物多样性分析公司，虽然自己不是很精通，但是也自己操作过一点点，听同事也讲过一点点，希望对你有帮助。
1 由于目前功能基因没有专门的数据库，所以测序完成后，我们也是用NCBI进行BLAST比对的。
2 由于环境中，没有鉴别的微生物太多，注定环境样本中uncultured的很多，unclassified的也很多。像我们给客户做的结果，对于环境样本，unclassified的很多，在种水平有的能达到80-90%。
3 做完了OTU注释后，需要把相同种属的在进行一次整理。例如OTU1 、OTU30可能属于同一种，注释完成后，需要将他们重新再进行整理，合并到一起。
4 BLAST比对后，至于选择前10还是前30，每个公司不一致，这个也没有标准规定。
5 如果实在搞不懂，可以将你的数据部分外包给公司，然后看一下公司是怎么做的，请教一下公司技术人员，这样理解学习起来会更快一些。