24小时热门版块排行榜

返回列表

当前主题已经存档。

bulebird

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 726.4
散金: 21
帖子: 275
在线: 52.3小时
虫号: 398545
注册: 2007-06-10
性别: GG
专业: 工业生物技术

[交流] 《Pichia Fermentation Process Guidelines》中文版

毕赤酵母发酵过程指导手册

一、概述
和酿酒酵母一样，毕赤酵母特别适合于发酵培养。在培养过程中毕赤酵母能达到高细胞密度，因此能提高蛋白产量。
因为发酵罐种类繁多，因此很难提供细致的步骤以满足具体情况。以下给出的指导方针是Mut+和Muts毕赤酵母在15L玻璃发酵罐的试验基础上得到的。

序号主题                            页码
1. 发酵参数                            1
2. 设备及培养基                   2
3. DO的测量及应用                   2～3
4. 种子培养                               3
5. 以甘油为碳源的分批及补料培养       3～5
6. 流加甲醇诱导Mut+和Muts重组体       5～6
7. 收集和破碎细胞                   6
8. 参考文献                            7
9. 培养基配方                            7

发酵参数：
在发酵过程中控制以下参数非常重要。下表描述了参数控制范围及其控制原因。
参数                                                    原因
温度（30.0℃）                                  温度高于32℃时对蛋白表达有害
DO（>20%）                                  毕赤酵母在有氧条件下才能代谢甘油和甲醇
pH（5.0～6.0和3.0）                                  pH对菌体生长和蛋白分泌很重要
转速（500～1500rpm）                      使培养基中氧气浓度达到最大值
通风量（0.1～1.0 vvm，即：每L培养液每分钟0.1～1.0L氧气）使培养基中氧气浓度达到最大值
消泡剂（用最少量的消泡剂消除泡沫）             过量的泡沫使分泌的蛋白变性并减小发酵罐的空间
碳源（可变的速率）                                  在发酵不同阶段必须以不同的速率添加不同的碳源

设备
有加套装置，能提供5～10℃冷水，维持发酵过程中尤其是甲醇诱导阶段的温度；
消泡系统；
能提供氧气：空气（不锈钢发酵罐1～2vvm），或者纯氧（玻璃发酵罐0.1～0.3vvm）；
蠕动泵：流加补料和诱导培养基；
pH自动控制装置。
培养基的制备
发酵基础培养基（见附录）
PTM1微量盐溶液（见附录）
按初始发酵液体积计算，每升发酵液配制～75mL甘油培养基。补料培养基：50%w/v甘油，每1000mL含有12mLPTM1微量元素溶液。
按初始发酵液体积计算，每升发酵液配制～740mL甲醇培养基。诱导培养基：100%甲醇，每升甲醇含有12mLPTM1微量元素溶液。
毕赤酵母生长状态的监控方法
采用600nm下（OD600）的吸光度和细胞湿重来监控不同时间点的菌体生长情况。培养基中可利用碳源的变化会引起溶氧（DO）的变化，因此，观察溶氧浓度的变化情况可监控菌体代谢速率。
二、溶氧（DO）的测量及应用
引言
溶氧浓度是氧气在培养基中的相对含量，100%溶氧是以氧气在培养基中达到饱和状态时为基准。毕赤酵母在生长过程中会消耗氧气，使培养基中氧气浓度减少。因为甲醇代谢第一步需要氧气，所以维持DO在20%以上是很重要的，以确保毕赤酵母能利用甲醇生长。精确的测量和观察DO值的变化有利于掌握菌体的生长状态。因此，精确校准仪器是非常重要的。请仔细阅读操作手册。
维持溶氧浓度（DO）
1.依靠氧传递速率（OTR），尤其是小规模的玻璃发酵容器，来维持溶氧在20%以上是困难的。在玻璃发酵罐中，为了使溶氧保持在20%以上，通常需保持通氧量为0.1～0.3vvm。氧气消耗量随甲醇添加量和蛋白表达量而变化。
2.通氧量要达到0.1～0.3vvm以达到适当的DO水平。在玻璃发酵罐中，可以持续通入空气以达到这个目标。在不锈钢发酵容器中，可以通过增加压力提高OTR。使用特殊发酵罐时要仔细阅读操作手册。
3.如果发酵罐不能提供足够的氧气，应相应的降低甲醇流加速度。注意：甲醇含量减少会降低蛋白表达量。
4.为了达到最大蛋白表达量，在流加甲醇总量基本保持不变的情况下，应以较低的流加速率以延长发酵时间。对于大多数重组蛋白，甲醇消耗量和产生蛋白量之间有直接的关系。
DO值的应用
在生长中，菌体耗氧，保持培养基中DO浓度低。注意：当微生物以甘油或甲醇为碳源进行生长时均会耗氧。DO可以用来评价微生物的代谢速度和限制性碳源。代谢速度表明菌体生长是否良好。如果你将完全诱导AOX1启动子，那么确定限制性碳源是很重要的。例如，在流加甲醇前，DO的变化（DO峰值）能让你确定甘油是否消耗完全。另外，它能确保甲醇流加量不超过其消耗量。过量的甲醇（>1～2%）对菌体有毒害作用。
DO操作
如果是限制性碳源，则减少其含量会导致菌体代谢速率下降，并使DO上升达到峰值。终止流加碳源，使DO提高10%，看提高10%需要多长时间，之后再恢复流加碳源。如果时间间隔小于1分钟，那么就是限制性碳源。
三、准备发酵罐和甘油分批培养阶段
三角瓶种子培养
切记挡板瓶中不要装入过多培养基，培养基体积应控制在三角瓶总体积的10～30%。
1.挡板瓶中转入含有初始发酵液体积5～10%的MGY或BMGY培养基，接入保存在MD、MGY或甘油管中的菌种。
2.在30℃，250～300rpm下培养16～24h，使OD600达到2～6。为了精确测量OD600，培养液需稀释10倍。
甘油分批培养阶段：
1.在发酵罐中装入含有4%甘油的发酵基础培养基（见培养基制备，第11页），然后灭菌。
2.将灭菌后的培养基冷却至30℃，调整转速和通风量达到操作条件（通常最大转速和0.1～1.0vvm空气），用28%氨水（未稀释的氨水）调整培养基pH至5.0。在无菌条件下每升培养基添加4.35mLPTM1微量元素溶液。
3.以初始发酵体积5～10%的接种量接种发酵。注意：在微生物开始生长前，DO将会接近100%。当微生物开始生长时，它会消耗氧气，导致DO降低。通过通入氧气使DO保持在20%以上。
4.使微生物生长直至甘油完全消耗殆尽（约18～24h），此时DO会增加至接近100%。注意：甘油消耗完的时间根据菌体密度的不同而不一样。
5.在每一个发酵阶段的后期要取样进行分析，一天至少两次。每个时间点取样10mL，然后从这10mL样品中取出1mL。样品被用来分析细胞生长情况（OD600，细胞湿重），pH，镜检，蛋白浓度和活性测定。将样品保存在-80℃下以备后续分析检测。下一步进入流加甘油培养阶段。
产量
这一阶段，细胞湿重将达到90～150g/L。因为没有流加诱导物甲醇，所以不会产生重组蛋白。
四、甘油分批补料培养阶段
引言
在上一步骤中甘油耗尽后，在限制性条件下开始流加甘油培养阶段，进一步增加生物量。当准备开始流加甲醇诱导时，可根据DO是否达到峰值来判断甘油是否消耗完全。
流加甘油培养阶段：
1.补料培养基：50%w/v甘油，每1000mL含有12mLPTM1微量元素溶液。流加速度：18.15mL/h/L初始发酵体积。
2.这一阶段将进行4h或更长时间。当无重组蛋白产生时，在这一阶段的后期细胞湿重将达到180～220g/L。
注意事项：
蛋白的表达量取决于这一阶段的细胞积累量。这一阶段培养时间可根据实际情况进行调整以使蛋白产量达到最大。建议在细胞湿重50～300g/L范围内进行研究。在这一阶段应控制甘油浓度在4%以内，因为甘油浓度过高对细胞会有毒害作用。
重要提示：
如果DO下降到20%以下，立即停止流加甘油或甲醇，也不要进行其它操作来增加氧传递速率，直至DO达到峰值。此时，可调整转速、通风量、压力或氧气量。
蛋白酶：
有文献报道称，如果发酵液pH降低接近3.0时，中性蛋白酶会受到抑制。如果你认为中性蛋白酶会降低蛋白的产量，可在甘油流加培养阶段或甲醇诱导开始时（下一步骤）将pH设置至3.0，通过菌体的代谢活动将pH慢慢降低至pH3.0，约需4～5h。
另外，如果蛋白对低pH敏感，有报道称酪蛋白水解物的内含物也会降低蛋白酶的活性。
五、甲醇分批补料阶段
引言
在开始进行流加甲醇诱导AOX1启动子前，所有甘油必须消耗殆尽。不过，有报道称利用甘油和甲醇的混合物进行流加培养表达重组蛋白已经获得成功。刚开始甲醇流加速度一定要慢，使菌体慢慢适应以甲醇为碳源生长。如果流加甲醇速度太快，将会造成菌体死亡。当菌体适应甲醇后，利用DO峰值来分析菌体的生长状态，并在诱导过程中利用DO峰值时间点来优化蛋白表达量。以甲醇为生长碳源会产生大量的热，因此在这一阶段控制温度是非常重要的。
Mut+流加甲醇培养阶段：
1.终止甘油流加培养，开始甲醇诱导阶段。诱导培养基：100%甲醇，每升甲醇含有12mLPTM1微量元素溶液。流加速度：3.6 mL/h/L初始发酵体积。
2.在初始的2～3h，是菌体对甲醇的适应期，甲醇会在发酵罐中积累，DO值不稳定。最终DO会达到稳定状态并保持稳定状态。
3.如果DO不能保持在20%以上，应停止流加，等待DO达到峰值后再继续以当前的速度流加甲醇溶液。增加搅拌转速、通风量、压力或氧分压保持DO在20%以上。
4.当菌体完全适应利用甲醇（2～4h），并以甲醇为限制性碳源，DO值会达到稳定状态并且能以很短的时间达到峰值（通常在1min之内）。在适应期后，保持以低速度流加甲醇至少1h，之后将流加速度提高1倍，为7.3mL/h/L初始发酵体积。
5.在以7.3mL/h/L的流加速度培养2h后，将流加速度增加到10.9 mL/h/L初始发酵体积，并保持至发酵结束。
6.整个甲醇流加过程大约持续70h，每升初始发酵体积大约需流加740mL甲醇。但是，这也会随蛋白的不同而变化。
注意：上清液会变成绿色，这是正常的。
产量
在甲醇分批补料发酵阶段，细胞密度进一步增加，湿重能达到350～450 g/L。因为大部分发酵采用分批补料方式，所以最终发酵液体积将是初始发酵液体积的2倍。
Muts菌株的发酵：
Muts菌株代谢甲醇的能力差，因此消耗氧气量非常低。所以，不能利用DO来判断菌体状态。在标准的Muts菌株发酵中，调整甲醇流加速度以维持培养基中含有甲醇但浓度不超过0.3%（可通过GC测定甲醇含量）。采用GC分析测量使甲醇浓度保持在无毒水平，采用以下经验式的指导方针进行Muts菌株发酵来表达蛋白。GC有利于进行分析和优化Muts菌株生长状态。
Muts菌株甲醇分批补料阶段：
Muts菌株的甘油培养和甘油流加培养这两个阶段的操作同如前所述的Mut+菌株。在甲醇诱导阶段，Muts菌株和Mut+菌株的区别在于甲醇流加的方式和数量。
1.诱导培养基同Mut+菌株。最初的2h流加速度为1mL/h/L初始发酵体积。之后每隔30min流加速度增加10%，直到达到3mL/h/L初始发酵体积，并维持至发酵结束。
2.甲醇流加将持续～100h。可调整诱导时间以优化蛋白表达。
六、收集和破碎细胞
引言
分离和提取产物的方法很多，下述方法和设备不是唯一的。细胞的数量或悬浮液的体积决定设备的种类。
分离菌体和悬浮液
对于1～10L的小型发酵罐，将发酵液收集到500～1000mL离心瓶中，通过离心分离菌体和上清液。对于大型的发酵，采用大型膜过滤系统（微孔过滤器）或离心机来分离菌体和上清液。最佳的分离方法取决于需要菌体或上清液作为蛋白的来源和你所能利用到的。上清液可直接通过净化柱或超滤系统进一步纯化。
细胞溶解
推荐使用玻璃珠破碎分解细胞，详见Current Protocols in Molecular Biology 13.13.4（Ausubel等，1990），或Guide to Protein Purification（Deutscher，1990）。当细胞数量大时，此方法就显得繁琐，用microfluidizer非常好。采用挤压细胞的方法不如采用玻璃珠和microfluidizer的效果好。
参考文献：略。
附：培养基配方1.发酵基础培养基：
85%磷酸 26.7mL
硫酸钙 0.93g
硫酸钾 18.2g
七水合硫酸镁 14.9g
氢氧化钾 4.13g
甘油 40g
用蒸馏水定容至1000mL，灭菌。

2.PTM1微量元素溶液：
五水合硫酸铜 6.0g
碘化钠 0.08g
一水硫酸锰 3.0g
钼酸钠 0.2g
硼酸 0.02g
氯化钴 0.5g
硫酸锌 20.0g
七水硫酸亚铁 65.0g
VH（生物素） 0.2g
硫酸 5.0mL
用蒸馏水定容至1000mL，过滤灭菌，室温保存。

[ Last edited by bulebird on 2009-3-18 at 16:10 ]

回复此楼