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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 二次PCR无法扩增
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流光色

新虫 (初入文坛)

[求助] 二次PCR无法扩增 已有1人参与

这个2000BP的片段一直是我们P不出来的，我偶然一次P出来了一条很亮的带，之后酶切切胶回收
然后连接一直连不上，做了二次PCR，用的第一次的前引物和目的片段的后引物，P出来的是很长一条暗淡的带
我这是假阳性还是我的片段降解了
我的前后引物Tm值是64和71，PCR用的57°C，后面也一直P不出来了
时间设置是95℃5min 95℃30S 57℃30S 72℃1min20s,72℃10min,感觉也没什么问题，但是第一次之后就再也P不出来了
加了DMSO
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1楼 2017-11-27 12:40:40
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先试gradient..........................
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2楼2017-11-27 14:02:47
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yuangauss

铁虫 (初入文坛)
PCR产物做模板是不太好，可以在PCR体系中添加0.9-2%的DMSO，增加扩增效率，或者将其连到平端或T载体上，测序验证正确后用连接好的质粒做模板就可以了，或者尝试换个引物位点，重新设计一对引物，重新扩增
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3楼2017-11-30 22:33:37
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