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原理 激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一，它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。 2 基本功能 1）多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集。 2）无损伤连续光学切片图像的采集—显微“CT”。 3）三维图像重建。 4）时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描。通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化的动态跟踪。如测细胞内Ca2+、K+、Na+等离子浓度的变化。 5）感兴趣区域的扫描。 6）定位、定量测定。 7）图像处理功能。 3 荧光样品的制备要求 荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除 图象背景干净、干扰杂质少 4 样品观察的一般步骤及参数的选择 1)根据荧光探针的激发波长和发射波长；选择合适的激光器、激光功率，分光镜滤片和发射滤片。 2)确定扫描方式：点、线、面、三维扫描。 3)确定扫描密度(分辨率)：分辨率越高，扫描速度越慢，图像信噪比越好，但也越容易发生光漂白； 4)选取物镜的倍数及电子放大倍数：这个条件被确定后，扫描范围即被确定，物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此，应尽量选择高数值孔径的物镜。 5)根据样品的制备质量选择合适的针孔大小，调整激光管电压、光电倍增管功率、降噪等至最佳状态，这些参数选择或设置有非常密切的关系，选择时应综合考虑。 (6)确定光切范围，即扫描样品的厚度，锁定起始位置和结束位置。 (7)给出光切的层数及取图时累计平均次数。 (8)获取图像并保存。 5 注意事项 1)实验室电源电压稳定，保持一定的温度，最好保持在21℃±1℃。 (2)注意防尘，工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。 (3)严格按照操作规则使用，避免因使用不当造成损坏。注意开机关机的顺序及激光管的保护,使用需预热约半小时。 (4)注意保护仪器的光纤，防止被挤压； (5)扫描后的图像及数据严禁用软盘拷贝,以防病毒浸染激光共聚焦显微镜系统。 (6)室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白； 6 在生物学中的应用 1）原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构： 检测核酸、检测蛋白质细胞定位、检测细胞凋亡、细胞器的观察及测定、检测细胞融合、观察细胞骨架、检测细胞间缝隙连接通讯、检测细胞内脂肪； 2）活体细胞或组织功能的实时动态监测 实时定量测定细胞内Ca2+变化、测定细胞内pH变化、检测膜电位变化、检测细胞内活性氧物种的产生、检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位、检测荧光共振能量转移、检测荧光漂白恢复； 参考文献： 王珺,龚 坚,王 燕,唐 微，《激光扫描共聚焦显微镜的使用与维护》，医疗装备2009第6期 |
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