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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 从cDNA中无法扩增到很长的目的基因
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)

[求助] 从cDNA中无法扩增到很长的目的基因

请问各位分子生物学的大神们，最近我做基因敲除需要回补几个很长的基因，一个基因的CDS有9000bp，另一个5000bp，从cDNA中一直扩不到目的条带，而且就算扩下来也担心在扩增过程中会有突变，导致整合上基因组后无法正确表达。有试过用自己的特异性引物从RNA反转录出特意的cDNA，然后以此为模板再一次扩增目的条带，目前看来也是失败。不知是否可以一小段一小段扩增，然后交给公司去拼接？请有经验的大神们帮忙提点建议，十分感谢！
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好好学习
1楼 2017-11-24 17:13:07
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cosmos796

禁虫 (职业作家)
本帖内容被屏蔽
2楼2017-11-24 17:17:47
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)
已经用特异性引物分段反转录，然后用高保真酶扩增出来片段，最后用重组酶进行重组构建质粒

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好好学习
3楼2017-12-04 22:39:38
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含笑少年。

新虫 (初入文坛)
就算是拆开扩，将近10k的片段不可能保证完全没有突变。。有序列的话找个公司做全基因合成吧。。

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4楼2017-12-06 13:53:54
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含笑少年。

新虫 (初入文坛)
要不自己做的话费时费力。。

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5楼2017-12-06 13:54:18
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alissawang

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 吕葱葱同学 at 2017-12-04 22:39:38
已经用特异性引物分段反转录，然后用高保真酶扩增出来片段，最后用重组酶进行重组构建质粒

请问这种方法可以用来合成2kb的基因吗？重组酶贵吗？
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6楼2021-02-04 20:00:30
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