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线性范围对western blot定量有什么影响
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当western blot进行定量时，许多人认为只需将感兴趣的蛋白质成像，剥离，重孵育内参蛋白，然后将其用于归一化，而不考虑线性范围的检测。 然而，与此有关的几个误区，越来越多的期刊现在要求一个适当的定义的标准化流程，包括线性检测的证明，还包括所有草稿。 线性检测是条带强度与膜上目标蛋白成比例的区域。 随着蛋白量增加，条带强度应该增加。 在下面的图片中，您可以看到问题在哪里，线性范围标有蓝色框，在该区域之外，该比例关系丢失，特别是在信号完全过饱和或极低的表达量时。【图一】 蛋白质印迹的定量在目标蛋白和上样对照两者都具有相似的线性范围的情况下，蛋白质印迹定量才是真正准确，因此，当上样质控对照被考虑时，事情变得更复杂。 这在下面的两张图中显示; 在第一个检测线性范围重叠的地方，蛋白质在该重叠区域内的定量将是很好的。 然而，在后者中，它们不重叠，容易看出蛋白质浓度的变化如何影响一种蛋白条带强度，而不影响另一种蛋白质的条带强度。 在这种情况下，定量是不准确的。【图二】 确定线性范围相对容易，可以通过样品并进行连续稀释来实现。 如果线性范围重叠，则确定要加载的样品量也同样容易。 然而，如果范围不重叠，如评估高表达的看家基因相关联的低丰度蛋白是非常常见的，定量就变得很困难。 此外，如果你感兴趣的蛋白被刺激上升或下调，那么这可能会进一步干扰您尝试适应线性范围。 如果你的线性范围不重叠，我们该怎么办？ 但是，有几个办法可用。 经常被忽视的步骤是改变上样质控。 如果您知道您的蛋白质表达水平相对较低，则上样控制选择如beta-actin蛋白可能不合适。 在这些情况下，使用细胞器特异性蛋白质可能会更有益，如Lamin B1或HSP60，因为它们应该表达不是特别高，但是应注意确认这些蛋白是表达不会因为处理而发生改变 第二个选择是从单一内参上样质控转向总蛋白定量，作为质控的一种手段。 通过评估整个蛋白范围，产生更广泛的动态范围。 这些染色包括凝胶和膜染色，并且可以以各种不同的方式成像。 此外，如前所述，该技术是检查蛋白分离质量和转印效率非常好方法。 最后，可以在成像期间扩大动态范围。 胶片动态范围很差，曝光时间不准确的问题可能会使事情变得更加复杂。 凝胶和膜在成像系统里面进行成像，如我们的c系列。 诸如c600的成像系统和Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统能够在更宽的动态范围内进行成像，因此能够进行线性范围的检测。  图片1.png  图片2.jpg |
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2017-11-20 09:59:04, 246.5 K
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