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有关几丁质酶活的测定问题
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测几丁质酶活按照如下方法：反应组：2ml 0.1mol/l醋酸缓冲液加入1ml上清液+1ml胶质几丁质，37℃水浴90min后沸水浴 10min。 空白组：2.0m L 0.1mol/L 醋酸缓冲液加1.0m L 上清酶液，沸水浴10min，再加入 1ml胶体几丁质37℃水浴90min。 冷却，4000r/min 离心 5min 取 2.0m L 上清与 2.0m L DNS 溶液混匀 沸水浴反应 10min，冷却加入 6m L 蒸馏水，混匀蒸馏水为对照，分别测两组溶液的 OD540。 但是酶活测测了两次测不出来，空白组和对照组吸光度相差不大，都是0.02 0.03这样子，想请教下各位师兄师姐问题可能出在哪里。我的NAG标准曲线R方0.988，应该DNS试剂没问题，摇瓶中的菌也长出来了。后来怀疑水浴时间不够，上摇床摇了6d的时候，水浴过夜后测OD值，一共三株菌1/2/3有1和2的反应组沸水浴反应的时候出现蓝紫色絮状不溶物，测了吸光度0.1几0.1几，更神奇的是3号的空白对照也有少量不溶物，后来测OD值得时候吸光度00.08几，其他试管均为0.04 0.03是为什么呢？我试管没洗干净？如若测得是正常的那酶活也有点低啊，我胶体几丁质底物加少了么？1个几丁质制备100ml胶体几丁质，加入1ml做反应底物少不少？ |
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