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请问做细菌功能基因组，3-5K的片段总是连不上载体是怎么回事呢？
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选用的载体是pZ，用线性化引物扩出来之后切胶回收2k多的那条带，然后进行去磷酸化。 DNA方面我做了几组对照： （1）已知目的基因的pcr产物（大小900bp左右； r taq酶扩增，有加A尾） （2）已知目的基因的pcr产物（大小2.7kb左右； ex taq酶扩增，有加A尾） （3）已知目的基因的pcr产物（大小2.7kb左右； KOD酶扩增，不加尾，平端） （4）Covaris片段打碎仪打碎的片断（大小3-5K） （5）Sau3AI酶切产物（DNA基因组）（条带弥散，大多集中在3-5K） 将上述有加尾的DNA片段都经过END-IT末端修复酶处理（lucigen），纯化后所有5组DNA都与载体连接，用的是FAST-LINK连接酶（lucigen），连接产物纯化后扩插入片段。 结果：只有第一组的900bp左右产物能顺利连上；第二、三组在2k-3k区域有片段，但大小不对，电转后涂板挑菌摇菌提模板后扩插入片段，无条带，证明不是目的片段。 请问有大神可以帮我看下哪里出问题了吗？ 论坛新手，没有金币，抱歉了各位！  |
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