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Catherine92

金虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[交流] 细胞冻存、复苏、计数存活测试及污染处理已有4人参与

一般来说，细胞进行转移，最佳的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融，这样可以最大限度的保存细胞活力。

材料准备：
1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。
2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。
3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1~2ml）。
4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。
5、试剂：PBS,胎牛血清，DMSO，培养液，双抗，胰蛋白酶（0.25%）。

细胞冻存：
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。
1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。
2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。
3、离心1000 rpm,5 min。
4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。
5、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏：
1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2、从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。
3、离心，1000 rpm，5 min。
4、弃去上层清液，加入含10%胎牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。
5、次日更换一次培养液，继续培养。

细胞计数及存活测试：
1、原理：
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤：
(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4=细胞数/ml
每一大格的体积=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×10 5细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
★注意要点
1、冷冻越慢越好，复苏越快越好。
2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。
3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。
4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。
5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。
6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。
7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。

细胞污染除菌步骤：
①  Nocard Rid(支原体去除剂)
（1）将Nocard Rid与完全培养液按1:800～1000比例稀释，加入细胞正常培养；
（2）根据细胞污染的严重程度，处理3～6次即可完全清除细胞支原体污染问题。
② MycoTest  Kit(支原体检测试剂盒)
MycoTest Kit是利用降落聚合酶链式反应技术（TD-PCR）对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。该方法灵敏度高，特异性强，可用于各种生物材料（如细胞培养基、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。
③ Nabact  Rid(黑胶虫去除剂)
在细胞培养的时候，有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动，小黑点有时呈点状，有时呈小的片状，运动形式为在原地振动（类似布朗运动），这就是黑胶虫。
（1）推荐Nabact Rid的稀释比例为1:500，例如：5 mL培养基加入10 μL的Nabact Rid；
（2）弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入新鲜的含有Nabact Rid的培养基，2天1次，连续处理3个周期。
④ Candida  Rid(念珠菌清除剂)
Candida Rid 通过特异性的破坏真菌细胞壁的结构，让真菌细胞失去固有形态及完整性，从而影响念珠菌属的正常代谢、离子交换和渗透压，让细胞彻底摆脱念珠菌的困扰，确保细胞的健康生长。
（1）用PBS冲洗细胞3～5次，每次都从一个方向冲洗倒掉；
（2）推荐将Candida Rid与完全培养液按1:500比例稀释，加入细胞正常培养；
⑤  Paebacl  Rid(杆菌去除剂)
杆菌（Bacillus Cohn）呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，以周生鞭毛运动。当细胞出现杆菌污染，会在显微镜下看到一些杆状游动的小虫子，对各种抗生素都有很强的耐药性，很难清除，且增殖很快跟细胞竞争营养，培养液不会变混浊。
（1）发现细胞有杆菌污染，弃掉培养基，用pbs清洗3遍；
（2）然后按1:1000 比例加入Paebacl Rid 试剂，即：边加边摇匀；
（3）每天处理一次，Paebacl Rid 连续处理三天，即可完全清除杆菌污染。
Cell+_细胞房除菌剂
（1）在细胞房及实验室空间，喷两层层即可快速杀灭常见污染源；
（2）喷洒本品后，需将细胞房或实验室密闭10-20min后使用。
Cell+_培养箱除菌剂
（1）在CO2培养箱内壁及空间，喷三层即可快速杀灭常见污染源，也可对环境空气灭菌；
（2）经试验验证，处理培养箱污染对常见细胞培养无任何影响，无需将细胞移出培养箱；
（3）建议CO2培养箱每1-2周处理一次。
Cell+_水盘抑菌剂
（1）首次使用，请先将培养箱水盘清洗干净，然后推荐使用培养箱除菌剂（ZF602）或75%酒精擦拭；最后按照1:100的比例向水盘中加入水盘抑菌剂处理过的水（即：1L水加入10 mL水盘抑菌剂）；
（2）再次使用，可直接按照1:100的比例向水盘中加入本品，每7-10天处理一次。
Cell+_水浴锅抑菌剂
（1）直接按照1:1000的比例向水浴锅中加入本品，每7-10天处理一次。

文章来源：www.zfdows.com

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