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Azure Biosystems Western blotting之实验秘籍
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蛋白分离、杂交、检测、分析 前瞻回顾 鉴于小编在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之实验方法的选择》中和大家聊了Western blot的实验方法选择，相信大家已经将您的western blot 实验方法选择好了，那么这期小编和大家聊聊western blot的实验流程中的那些事。 蛋白分离（图一） 电泳准备？ 玻璃配胶板要清洗干净，以免引起配胶问题，影响蛋白分离 配胶液要充分混匀，凝聚时间要够，如胶凝聚不均匀，会造成胶分辨率差。出现笑脸皱眉条带 电泳时，上样体积和浓度最好保持一致，这样可以防止出现条带过宽或者过窄的情况产生 如何选择膜？ 膜上有蛋白质的结合位点，可结合从凝胶中转移的蛋白质。常用的膜是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。 NC膜 低分子量蛋白检测 通常用于化学发光法 蛋白剥离效果不理想 PVDF膜 低表达蛋白结合能力强 通常用于荧光方法（自发荧光背景低） 剥离和二次杂交时，蛋白的截留能力强 如何建立转膜系统 常用的转膜系统形式为 “三明治” 结构，凝胶和膜紧密贴合，放在两张转印滤纸之间，用电极板夹夹住，置于转印buffer中，正负电极通电后，将蛋白质从凝胶转移到膜上。转印滤纸 （滤纸） 能够保持均匀一致的压力，确保膜和凝胶间没有空隙，并保持转移buffer充盈在“三明治”结构中蛋白完全从凝胶转移至膜上。 Blot前准备什么？ 当优化转印设置、条件及实验时，最重要的是确定样品中所有蛋白是否从胶上完全转移到膜上。使用SelfStainTM免染胶来显示膜上的所有蛋白 ，并立即进行western blot后续步骤。 杂交（图二） 膜封闭 封闭目的是防止非特异性结合，降低背景对目的信号的干扰。如使用脱脂奶粉做封闭液，最好将脱脂奶粉进行滤膜过滤，这样可以减少后期颗粒背景的产生。 一抗孵育 确保新的一抗浓度经过优化。如有确证过的一抗，可尝试将一抗标记荧光染料，直接进行一步法Western blot检测。 洗膜和二抗孵育 每次孵育后，洗去多余的抗体对于降低背景信号至关重要。荧光方法Western blot中，洗膜还可以去除有自发荧光的去垢剂。洗膜的时候如果多张，建议分开进行清洗，同时洗膜液体积不能太少。 化学发光检测 尝试不同的底物增加灵敏度和信号持久性；化学发光底物使用前需要平衡至室温，可以增加酶的活性；数字成像系统要灵敏度很高。 荧光检测 保持所有物品的清洁，确保无背景干扰；印迹膜避光保存；使用背景淬灭板降低背景荧光，增强信噪比。 检测 Azure Biosystems c系列成像系统（图三） Azure c 系列成像系统提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系统。可以选择满足现有实验需求的型号，当需要提升应用范围时，通过升级即可完成（图四） 分析 AzureSpot分析软件 AzureSpot 分析软件作为分析胶和膜的工具，把复杂的分析变得简单化（图五）。 1.在样品上进行泳道划分 2.设置阈值，检测条带（图六） 3.扣除背景，提供有多种背景扣除方法可选（图七） 4.查看结果，可作出修改或对任意条带边界进行编辑（图八） 5.使用标准分子量marker来确定样品的分子量，或者使用标准品来确定浓度（图九）  图片1.jpg  图片2.jpg  图片3.jpg  图片4.jpg  图片5.jpg  图片6.jpg  图片7.jpg  图片8.jpg  图片9.jpg |
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2017-10-23 17:06:31, 317.3 K
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