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vaie

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 构建潮霉素筛选的稳定转染细胞系问题求解（HEK293T）

小木虫的各位大神好！我在做一个用潮霉素筛选稳转基因的实验，步骤大致如下：

1. 铺6孔板，等细胞密度到70-80%，用Lipo2000转染；

2. 24h后，消化细胞到密度为原来的1/4（即1个孔消化成4个孔）；

3. 24h后，加入不同浓度的潮霉素（150，300，400, 500 μg/mL）；

4. 观察细胞，死细胞多或溶液变黄时换液。

这是我们一个在美国的合作者以前的实验方案，质粒也是他提供的。他做的时候，加入潮霉素细胞不会死亡很多，然后会长满整个孔，再传代扩大培养。但是我自己做的时候，细胞在加入潮霉素后2-3天就死了大部分，剩下不超过10个，慢慢长成一个圆形的克隆，但生长非常缓慢，我等了近2个月还是老样子。

我也用细胞刮刀把克隆挑取到96孔板中，刚开始长势良好，爬满整个底部，但再传代就死了。或者干脆长不起来，一周左右就自发死亡。挑过20几次单克隆，全部失败，就放弃了。

死亡形态就是细胞变圆，漂浮在溶液中，没有观察到真菌和细菌的污染。

最近做的一次，加入潮霉素后长起来的5-6个克隆，在2周左右也全部自发死亡了。一脸懵逼。。

所以现在就是，想挑单克隆但细胞在96孔板里长不起来。想等6孔板自己长满，又长得太慢。有时候长出来的但克隆还莫名其妙就死了。无限心塞。。

求各位大神指点迷津！小妹在此谢过！