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zhangfuyan金虫 (小有名气)
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[交流]
有人做过关于同源克隆的实验吗？
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| 最近导师出了一个课题，关于同源克隆（植物类）的实验，以前没有接触过，不知道是怎么回事，希望有朋友做过这方面实验的给我说说最基本的知识，谢谢了 |
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zhangfuyan(金币+1,VIP+0):谢谢了 2-16 14:03
zhangfuyan(金币+1,VIP+0):谢谢了 2-16 14:03
| 杜氏藻是一种真核单细胞绿藻，可以在0.1～5.5mol／L的NaCl溶液中生存。杜氏藻之所以能耐受盐逆境与其细胞内具有一套独特的渗透压调节机制和β-胡罗卜素合成途径有关。为了从基因水平上研究其耐盐机制，本实验室利用传统的同源克隆的方法成功克隆到盐生杜氏藻cbr基因并将其转入模式植物烟草中，为下一步功能研究打下了实验基础。本实验研究的主要内容包括：1．利用同源克隆的方法从盐生杜氏藻中顺利克隆到一条250bp的cDNA片段，测序分析发现其同D.bardwail的cbr基因有67.0％的同源性，然后以该片段为基础，利用RACE技术构建了其全长序列；2．对盐生杜氏藻进行渗透震扰3h、6h、12h、24h、48h，然后利用半定量RT-PCR技术分析了渗透震扰对cbr基因表达的影响，结果发现高渗和低渗震扰对cbr基因表达的影响明显不同；3．构建中间载体pCAMBIA2301G，再用它和cbr构建了可在植物中高效表达cbr的载体pCAMBIA2301G-cbr，并将该质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；4．叶盘法转化烟草(Nicotianatabacum)。烟草叶... |
2楼2009-02-14 19:19:02
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zhangfuyan(金币+2,VIP+0):我又回复你了 2-16 14:02
zhangfuyan(金币+2,VIP+0):我又回复你了 2-16 14:02
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同学，你如果做植物的同源克隆，首先，明确要克隆什么DNA element。是克隆coding gene, 还是promoter，还是Ribosome entry site等等。 然后，去找近缘物种，假如，近缘物种，已经有相关序列数据公布了。那你把它下载下来，然后，有几种方法。 1st，提取基因组DNA，根据已知的序列设计多组引物，然后去PCR，只要产生一条可分离的序列，就可以借助它做walking，或addaptor，或inverse pcr。 2st，假如是编码序列，可以提总RNA，用反转录的方法，得到cDNA，然后5'race, 3'race，扩出条带也是可以滴。 |
3楼2009-02-16 12:03:40
zhangfuyan
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4楼2009-02-16 13:57:54
5楼2009-02-16 20:26:23
zhangfuyan
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6楼2009-02-17 11:27:35
7楼2009-02-17 21:05:34