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质粒图谱之火眼金睛是如何炼成的？ 已有2人参与
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质粒和载体傻傻分不清楚 质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型。 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。细菌或病毒质粒是重组DNA技术中常用的载体。 简而言之，质粒可以说是一个统称，载体是质粒改造过用来运载的工具 选用质粒做载体的要求 以最常用的为例 （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒<10 个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何一眼看穿质粒图谱 ① 复制起始位点Ori，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒），Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 ② 再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 hygr：使潮霉素β失活。 ③ 看多克隆位点（MCS）：它具有多个限制内切酶的单一切点（质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列，不然就一刀好几段了），便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选，最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。 ④再看外源DNA插入片段大小：质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 ⑤ 是否含有表达系统元件，即启动子（promoter）－核糖体结合位点（RBS）－转录终止信号（AATAAA同时是poly A）。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 ⑥看报告基因：主要是为了能迅速检查功能基因是否表达的阳性判断，表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置。 ⑦看质粒图谱上的箭头：它代表DNA两条链（正义链和反义链），即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。 目的基因片段进行连接。 注意：不管从哪个途径得到的质粒载体，拿到之后一定要去测序公司测个序，验证该质粒的真伪或者是否有突变，再开始做实验。 |
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2楼2018-02-24 06:12:54
haluonihao
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