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一位“蛋白质纯化技术”的自白书··· 已有5人参与
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以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 一. 实验试剂及材料 实验材料：大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒：LB液体培养基、 氨苄青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸馏水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化钠 仪器、耗材：摇床 、离心机、 层析柱、 离心管、 移液枪、 枪头盒 、烧杯 、玻璃棒 二. 获得目的基因 1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 三. 构建重组表达载体 1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 四. 获得含重组表达质粒的表达菌种 1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2. 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3. 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 五. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3h。 4. 12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。 六. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化 1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA介质，并分别用8 mL 去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。 2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。 4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液，约3-4 h，取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。 5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。 七. 注意事项 1. 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。 2. 融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 3. 菌液OD值要小于1，否则细胞太浓太老，不易破碎，且质粒易丢失。 4. 诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。 5. 诱导温度适当摸索：25、30℃。 6. IPTG浓度：一般在1 mM 以内，可适当摸索。 7. 超声条件可视实际情况改变，只要使菌体裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。 |
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