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RubyRose新虫 (初入文坛)
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RCR primer design，Tm 已有1人参与
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学长学姐们好，要完成本科生实验，要将斑马鱼(D.rerio)的雌激素受体（estrogen receptor，ER) 转到商业化载体pGADT7中。 1. 在Genbank中找到了ER的基因 ID是 AB037185.1 全长2821bp 2. 找到合适的ORF 在195-1904 bp处 ， 我们的打算在ORF的上游和下游找一对引物 （就是PCR产物得包含这段ORF） 3. 我们用one step kit试剂盒 想将它转入质粒 我们用的是重组的方法 及 我们设计的引物要分为两段 一段和ER匹配（长度21nt） 一段和质粒匹配 用于重组（15nt）（overlap extension PCR） 4. 用oligo找引物 我们先不管那15nt 按照21nt的标准找 最终我们在36bp-56bp找到upprimer 在2008-2028 找到 lowerprimer 所以最终的引物就各自加上与质粒匹配的15nt question：1. Tm的确定 ， Tm是按照21nt的标准确定的 但在实际pcr扩增中 只有第一轮pcr 引物的长度才全是21nt 第二轮有的就会变成36bp Tm 不会不准吗 我想知道pcr里面具体发生了什么 这样的影响大不大 （我没做过这种实验 不知道实验结果对参数变动的容纳能力） 2. 我在ORF的上下游找引物 而不是恰好在ORF的两端找 这种方案可行吗 还是恰好在它的两端找 通过调整匹配碱基的个数来调参 这两种哪个好？ 发自小木虫IOS客户端 |
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