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微生物多样性测序需要多少重复？
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原创 2017-08-24 小师兄 统计学可行性 那每组一个重复不能开展差异检验分析的话，每组3个重复是否就可以了？从统计学来说，3个重复确实可以。例如一般的t检验，每组至少3个重复就能算均值方差，从而进行t检验。 但t检验本身是一种有监督检验方法，需要依赖数据符合正态分布，而在多次随机抽样中，微生物的丰度分布并不一定符合正态分布，因此有时候需要开展无监督检验方法。Wilcoxon秩和检验就是一种常用的方法。但我们通过其检验临界表可以发现，在0.01的水平下至少需要5个重复才能找到数据，也就是才能开展分析。 因此，总结来说，要开展有效的差异检验分析，必须要有至少3个，甚至5个样本重复才可以。 生物学合理性 考虑完分析的可行性之后，接下来我们讨论其合理性，也就是多少重复才算比较有数据代表性。由于微生物样本影响因素繁多，加上样本物种种类复杂，因此相比于转录组等样本来说，其离散程度较大。同时由于人为误差的必然存在（如采集到极端样本、操作失误等），因此，就算3，5个样本重复统计出来的显著差异，实际上并没有太多生物学意义。 举个例子，如果需要开发一种药物针对性治疗某种疾病，而这种疾病经过研究是与肠道微生物有关，那很自然想到通过分析寻找肠道群落的biomarker。现在有两个实验室同时对正常与疾病人群采样进行研究，其中A实验室每组采集3个样本作为重复，而B实验室每组采集50个样本。两个实验室都通过差异检验分析得到一些候选物种作为biomarker，你是药物研发公司的投资人，会选谁的结果作为依据来开发药物？ 很显然，在进行容错率越低的研究时候（例如药物研发，疾病机理等），我们需要更多的样本重复来消除背景误差，以精确的找到目标，因此B实验室的结果在这种环境下更让人“放心”。 同时，样本的复杂程度越高，理论需要的重复数也越多。因此推荐，一般的水体研究，可以开展5个左右重复，土壤10个以上，而人体肠道微生物研究，则推荐20个以上样本。 操作便捷性 前面我们所谈到的，都是理论问题。那实际操作当中呢，多少重复有利于实验的开展？ 由于实验条件的差异，经常造成测序所产生的数据量差别很大。例如同一批数据，同一组中某重复a、b的tag数目都是20万，另外一个重复c则是3万。我们可以采用抽平分析策略来解决数据量差异问题，但着会造成a、b数据的极大浪费。如果直接用原始数据进行分析，后期分析肯定会造成极大误差。其实由于c数据出现极端异常，很有可能是离群样本，因此合理的方法是把c样本剔除。但由于开始只有3个重复，在剔除样本后没办法开展后续差异分析。 为了解决这数据剔除的问题，最简单有效的方法就是在实验设计时候增加样本数，如果设计的是10个样本，那么后期就算剔除3个（已经非常多了），也还可以开展后续分析。当然，考虑到成本情况下，一般还是推荐至少5个重复。 |
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