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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 微生物代谢组学抽提的问题，希望做代谢组方面的人给予帮助，谢谢！！！
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奶牛人

铁虫 (初入文坛)

[求助] 微生物代谢组学抽提的问题，希望做代谢组方面的人给予帮助，谢谢！！！ 已有1人参与

本人做微生物代谢组学，现在抽提胞内代谢物用的是液氮反复冻融法进行抽提，具体是取一定量发酵液后，离心，倒上清，之后用0.85%NaCl清洗一次菌体，离心，倒上清，然后用与发酵液等量的80%甲醇抽提，先置于液氮中冻住，再在冰上解冻，解冻后涡旋5min，这个流程重复3次，之后离心，弃菌体，将甲醇冻干后用相应试剂复溶，用GC-MS进行检测。
目前的问题是这个方法有两个问题想请教大家一下：1、抽提效果有时候很好，物质比较多，峰形也好，但有时候峰非常少，或者除了内标之外完全没有峰；2、经常出现有大量甘油的情况，而我的这个菌是不可能产生这么多甘油的，不知道这些甘油从哪里来，冻干之后肉眼都可见。
现在基本能排除生长问题，菌生长状况都正常，OD也比较高；也基本能排除衍生化问题和机器问题，因为内标一直都很稳定，衍生化试剂也是即开即用，实验过程严格无水。
所以考虑可能是抽提的问题，想问一下大家做抽提的时候也像我一样实验结果经常不稳定吗？还是我抽提的步骤哪里有问题？另外抽提的时候偶尔会有大量甘油，又是从哪里来的？
谢谢解答！！
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1楼 2017-08-22 18:13:03
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笑侠楚留香

新虫 (小有名气)
感觉楼主的前处理方法就很有问题啊，是按文献里来的吗？

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蛋白组学/代谢组学
2楼2017-08-22 23:55:08
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
奶牛人: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2017-08-25 16:41:55
代谢组做的是有机酸还是蛋白质啊，如果是有机酸的话，用甲醇单抽，显然效果极差的。你看看文献看，我们这用的是甲醇/乙腈/丙酮，配比自己根据样品性质调整，有时候丙酮可以不加，但是感觉乙腈是必须加的。然后反复冻融法目的是啥？如果代谢组的话，目标应该是小分子多肽和有机酸的话，这些东西显然对反复冻融极其敏感啊。建议换方法，可以用化学法直接抽提。而且有机酸和多肽的抽提方法是不同的，依据文献吧。做组学分析，前处理是极其关键的
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奶牛人
3楼2017-08-23 08:48:22
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奶牛人

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-23 08:48:22
代谢组做的是有机酸还是蛋白质啊，如果是有机酸的话，用甲醇单抽，显然效果极差的。你看看文献看，我们这用的是甲醇/乙腈/丙酮，配比自己根据样品性质调整，有时候丙酮可以不加，但是感觉乙腈是必须加的。然后反复冻 ...

非常感谢您的解答，有几个问题想追问一下，我做代谢组目标物是有机酸、氨基酸，加上糖类和脂肪酸，物质希望尽可能的多，但是重点室有机酸和氨基酸，我的抽提方法是根据Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis这篇文献的方法来的，反复冻融的目的是尽可能使细胞破碎完全，抽提剂之前我试过甲醇、乙腈、水，效果和纯甲醇差不多，不过也是反复冻融，您说的小分子多肽和有机酸对反复冻融敏感给我的帮助很大，这个之前真的没考虑过，谢谢！不知道您说的化学抽提法具体流程是怎样的呢？方便给一个大致的流程我参考一下吗？谢谢！不胜感激！！
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4楼2017-08-23 20:11:07
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笑侠楚留香

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 奶牛人 at 2017-08-23 20:11:07
非常感谢您的解答，有几个问题想追问一下，我做代谢组目标物是有机酸、氨基酸，加上糖类和脂肪酸，物质希望尽可能的多，但是重点室有机酸和氨基酸，我的抽提方法是根据Methodological approaches to help unravel  ...

反复冻融代谢物会降解的，肯定不能这么做

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蛋白组学/代谢组学
5楼2017-08-24 08:35:08
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 奶牛人 at 2017-08-23 20:11:07
非常感谢您的解答，有几个问题想追问一下，我做代谢组目标物是有机酸、氨基酸，加上糖类和脂肪酸，物质希望尽可能的多，但是重点室有机酸和氨基酸，我的抽提方法是根据Methodological approaches to help unravel  ...

你可以用很简单的方法，比如甲醇破壁法，也可以用低频超声破碎，超声对大分子蛋白质的影响较大，而对小分子几乎没有影响。
然后，我觉得你要查下，你所用的菌种的有机酸提取方法，可以查下，对应菌株的脂肪酸分析相关文献，我估计差别不会太大，效果也不会差异过大。芽孢杆菌通常都比较难破壁，估计破壁方式都很暴力。化学抽提法，我用的很简单，就是等体积分数的甲醇，乙腈，乙醇，直接抽，有条件可以用分布式抽提法，就是用两种配比的抽提液，分别抽提，有同事说效果好一点，然后以前学校老师教过有个办法是用乙酸乙酯抽提，具体我没做过，据说效果也不错。
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6楼2017-08-24 08:48:45
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奶牛人

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笑侠楚留香 at 2017-08-24 08:35:08
反复冻融代谢物会降解的，肯定不能这么做
...

谢谢补充
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7楼2017-08-25 16:39:19
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奶牛人

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by snoopytbw at 2017-08-24 08:48:45
你可以用很简单的方法，比如甲醇破壁法，也可以用低频超声破碎，超声对大分子蛋白质的影响较大，而对小分子几乎没有影响。
然后，我觉得你要查下，你所用的菌种的有机酸提取方法，可以查下，对应菌株的脂肪酸分析 ...

谢谢！太感谢了！
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8楼2017-08-25 16:41:07
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