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湿转和干转，哪种方法更适合您的蛋白实验？
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湿转和干转，哪个方法更好 对于一个完美的westernblot实验，蛋白在聚丙烯凝胶中根据天然分子量进行分离，蛋白被很好的从凝胶上转移到固相支持物上，然后通过特异性的抗体进行免疫检测。 对于转印来说，使用湿转的方法是比较好的，因为凝胶和膜都能够完全浸没在转印buffer中，在半干转的条件下，转印是在两个电极板之间发生，这种类型的转印装置可能影响蛋白的转印效率和膜上的截留能力。对于优化蛋白的转印条件，每个系统的优缺点都应该考虑进去。 湿转 对于一个湿转过程，要建立一个三明治结构，顺序为海绵，滤纸，膜，胶，滤纸，和第二个海绵。在组装之前，需要将所有部分（包括胶）放在转印buffer中进行平衡，然后将堆叠的三明治结构用转印夹夹起来放在转印装置上，连上电极装置，蛋白在转印buffer中从胶上转移到膜上。大多数western blot实验应用都可以使用湿转。 半干转 对于半干转来说，也需要进行堆叠组装（滤纸，胶，膜需要放在转印buffer中进行预平衡）放在装置电极板的底部，盖上上极板，高强的电流通过三明治结构，转印速度较快，一般小于1h。 转印的注意事项 1.当准备转印buffer时一定要注意：小组分的不一致都可能影响转印 2.使用高质量，纯度高的甲醇溶液，如果甲醇质量不佳，会影响转膜的效率 3.不要稀释转印buffer 4.不要调整转印buffer的PH值 5.为了得到最佳的转印，buffer要使用新的 6.装置保持干净 7.使用一定厚度的胶（0.5-0.75） 8.如果使用PVDF膜，膜在转印之前需要在100%甲醇中进行浸泡 9.转印垫，滤纸，胶和膜需要在转印buffer中平衡至少15min 10.在转印的时候要将膜和胶之间的空泡赶走 11.确定电极是连接正确，避免不必要的损失 12.使用预染的分子量marker，来监控转印 13.对于难转印的蛋白，可以调整甲醇和SDS的浓度，SDS能够提升蛋白从胶上的迁移而抑制与膜的结合。甲醇能够促进蛋白和膜的结合，但是阻碍蛋白从胶上的迁移。 |
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2017-08-18 16:00:50, 205.67 K
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