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MTT比色法实验原理、步骤及注意事项 已有5人参与
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实验原理 MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 实验试剂 1. MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 2. 配制MTT时用PBS（pH=7.4）溶解。 PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g调pH7.4，定容1L。 实验步骤 普通MTT法实验步骤： 1. 接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积200ul. 2. 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3. 呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。 4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 药物MTT法实验步骤： 贴壁细胞： 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。 2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 悬浮细胞： 1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640） 2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4. 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 注意事项 1. 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。 2. 设置调零孔（只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul）。 3. 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。 4. MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。 5. 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充，因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。 6. 防止药物与MTT反应。如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是不需要的。 7. 吸收值分析。在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。 8. 培养过程中换液。100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果。如果培养时间长，在48h应该换液一次。 9. 避免血清干扰。高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 10. 判断污染。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。 11. 加DMSO前要把液体小心吸掉。但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法，悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板，清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞，可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸。 12.MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。 |
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