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FAST DNA spin kit提取土壤微生物总DNA遇到的一些疑问 已有2人参与
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为什么我用FAST DNA spin kit 提土壤总DNA ,然后用其产物PCR跑琼脂糖凝胶电泳，然后其条带在250bp左右？看文献上的土壤微生物DNA片段一般都有20多Kb,实验室没有fastprep，用的是旋涡混合仪，用的方法如下： Fast DNA® SPIN Kit for Soil土壤DNA快速提取试剂盒提取步骤 （没有FastPrep®仪器的情况下） （1）称取0.3 g~0.4 g样品加入Lysing Matrix E Tube 中。（注意：需保证加完样品及所需溶液后，管中应留出不少于200 μL 空间） （2）加入978 μL SPB，加入122 μL MT Buffer。 （3）盖紧Lysing Matrix E Tube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40 s~50 s。（注意：时间不可过长，有可能打断基因组DNA片段降低提取质量）从各个角度都可以震荡一下，不要光是底部。 （4）在8000 r/min转速下离心15 min，有利于去除体积较大或具有复杂细胞壁结构的样品碎屑。 （5）将上清液用大口枪头吸出转入1.5 mL的微离心管中，加入250 μL PPS，手持离心管晃动10次以混匀。 （6）在8000 r/min下离心5 min，用大口枪头将上清液转移至5 mL离心管中。 （7）摇匀Binding Matrix后，吸取1.0 mL加入上一步离心管中。 （8）将离心管上下颠倒2 min后，静置3 min，使DNA附着于Bingding Matrix上，并等待二氧化硅基质沉淀。（这一步根据沉淀情况时间可以适当延长） （9）小心移除600 μL上清液，避免吸出沉淀物。 （10）将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600 μL混合液移入SPIN Filter中，8000 r/min下离心1 min。 （11）倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至5 mL离心管中的液体吸尽。 （12）加入已制备好的SEWS-M溶液500 μL，用小枪头小心混匀后，8000 r/min下离心1 min后，弃去收集管中的液体。 （13）为更好的去除杂离子，重复第12步，更换为1.5 mL离心管。 （14）在8000 r/min下离心2 min，去除残留的SEWS-M溶液，然后更换为干净的1.5 mL离心管。（若发现残余溶液较多，可重复此步骤） （15）在室温下，将SPIN Filter风干5 min。（时间可以更久一些） （16）往SPIN Filter加入80 μL DES溶液，用小枪头小心使之与Binding Matrix 混匀，65℃水浴15 min（有利于DNA的溶出）。8000 r/min下离心2 min，可得到约50 μL的DNA溶液。再加入80 μL DES溶液重复第16步操作，一共可得到约100 μL的DNA溶液。 （17）弃去SPIN Filter，将提取好的DNA存于-20℃冰箱保存。 |
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