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bio转录组金虫 (正式写手)
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[求助]
过柱法提蛋白
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想直接从卵中提取蛋白，但是操作不熟悉，想请教一下相关大神，指导一下。 从卵匀浆中提蛋白，使用manman-agarose过柱法。 想咨询一下主要步骤和透析袋的使用方法。  |
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【答案】应助回帖
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Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合. 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~ 过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里. |
2楼2017-07-29 17:12:49
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3楼2017-08-18 21:09:47
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金虫 (正式写手)
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4楼2017-08-29 10:53:01
