应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 表达载体构建，Takara T4连接酶连接体系，在线等，急
41/1返回列表
查看: 11563  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

HSHK

新虫 (初入文坛)

[求助] 表达载体构建，Takara T4连接酶连接体系，在线等，急 已有1人参与

求助各位大牛，本人最近在做表达载体构建，连接产物转化至感受态中，平板培养14小时后没有长出菌落来，都已经做了好多次了，确定不是转化的问题，应该是连接体系的问题。想让大家帮我看看：PCR产物与载体（配GEX-4T-1）双酶切后胶回收纯化，浓度分别为30ng/ul,34ng/ul，跑了电泳如图（附件），上样量3ul,第2条带为载体（5000bp）,第3条带为PCR产物（1500bp）,我的连接体系是10ul,分别为PCR5ul,载体3ul,T4连接酶1ul，10x buffer 1ul, 4℃连接24小时，请问我的连接体系是否有问题，有师兄说是载体浓度太低，大家连接时用的PCR与载体的量是多少？我用的是Takara T4连接酶

表达载体构建，Takara T4连接酶连接体系，在线等，急
N)ON%`~YRK8TUK70E@BWGAX.png
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-07-27 21:24:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傲娇小丫头

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
HSHK(小冀-代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-28 09:06:08
觉得体系没有什么问题，我当时做链接是片段与载体比是5:1。然后是16度连接半个小时，如果半个小时连接效率低的话就16度过夜。我用的全式金的T4连接酶。
个人觉得既然你认为不是转化的原因，1、感受态是否处于正常状态，你可以转化一个空载质粒涂板看看结果 2、平板抗性是否正确 3、是否连接上，可以跑一下琼脂糖凝胶电泳，连接目的片段的载体肯定大于5000bp，所以看看是否有这有一条带 4、很有可能没有连接上，其原因可能是你的酶切位点问题，或者双酶切时有个酶没有切开等原因 ，只要目的片段或者载体上有一个酶没有切开就连不上啊 5、如果酶切连接的方法不行，可以采用同源重组法试一试。目前就想到这么多

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
一万年太久，只争朝夕。。。。。
2楼2017-07-27 23:57:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15623507725

新虫 (初入文坛)
你好，我也碰到了同样的问题。请问你现在有连上吗？之前连不上的原因是什么啊？能告诉我一下吗？
赞一下 回复此楼
3楼2018-03-19 09:59:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 傲娇小丫头 at 2017-07-27 23:57:36
觉得体系没有什么问题，我当时做链接是片段与载体比是5:1。然后是16度连接半个小时，如果半个小时连接效率低的话就16度过夜。我用的全式金的T4连接酶。
个人觉得既然你认为不是转化的原因，1、感受态是否处于正常状 ...

您好，我和楼主遇到的问题一样，只是我的能长出菌落但是一直验证不成功，现在怀疑是连接的问题，请问下能详细的说一下如何验证连接是否成功吗？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2018-11-27 13:35:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 HSHK 的主题更新
41/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +3 niko- 2026-03-22 3/150 2026-03-22 15:15 by 杨杨杨紫
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 318求调剂 +4 plum李子 2026-03-21 7/350 2026-03-22 14:17 by ColorlessPI
[考研] 306求调剂 +4 来好运来来来 2026-03-22 4/200 2026-03-22 12:43 by 素颜倾城1988
[考研] 354求调剂 +7 Tyoumou 2026-03-18 10/500 2026-03-22 11:11 by 人来盛
[考研] 化学工程321分求调剂 +18 大米饭！ 2026-03-15 22/1100 2026-03-21 20:20 by HH领袖
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 346求调剂[0856] +4 WayneLim327 2026-03-16 7/350 2026-03-21 04:02 by JourneyLucky
[考研] 299求调剂 +6 △小透明* 2026-03-17 6/300 2026-03-21 02:42 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂 +9 何润采123 2026-03-18 11/550 2026-03-20 23:19 by JourneyLucky
[考研] 330求调剂 +4 小材化本科 2026-03-18 4/200 2026-03-20 23:13 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +9 Doleres 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:36 by JourneyLucky
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +4 @taotao 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:14 by JourneyLucky
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +4 生物工程调剂 2026-03-16 12/600 2026-03-19 11:10 by 生物工程调剂
[考博] 26博士申请 +3 1042136743 2026-03-17 3/150 2026-03-17 23:30 by 轻松不少随
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭