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[求助]
表达载体构建，Takara T4连接酶连接体系，在线等，急 已有1人参与
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求助各位大牛，本人最近在做表达载体构建，连接产物转化至感受态中，平板培养14小时后没有长出菌落来，都已经做了好多次了，确定不是转化的问题，应该是连接体系的问题。想让大家帮我看看：PCR产物与载体（配GEX-4T-1）双酶切后胶回收纯化，浓度分别为30ng/ul,34ng/ul，跑了电泳如图（附件），上样量3ul,第2条带为载体（5000bp）,第3条带为PCR产物（1500bp）,我的连接体系是10ul,分别为PCR5ul,载体3ul,T4连接酶1ul，10x buffer 1ul, 4℃连接24小时，请问我的连接体系是否有问题，有师兄说是载体浓度太低，大家连接时用的PCR与载体的量是多少？我用的是Takara T4连接酶 N)ON%`~YRK8TUK70E@BWGAX.png |
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【答案】应助回帖
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HSHK(小冀-代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-28 09:06:08
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觉得体系没有什么问题，我当时做链接是片段与载体比是5:1。然后是16度连接半个小时，如果半个小时连接效率低的话就16度过夜。我用的全式金的T4连接酶。 个人觉得既然你认为不是转化的原因，1、感受态是否处于正常状态，你可以转化一个空载质粒涂板看看结果 2、平板抗性是否正确 3、是否连接上，可以跑一下琼脂糖凝胶电泳，连接目的片段的载体肯定大于5000bp，所以看看是否有这有一条带 4、很有可能没有连接上，其原因可能是你的酶切位点问题，或者双酶切时有个酶没有切开等原因 ，只要目的片段或者载体上有一个酶没有切开就连不上啊 5、如果酶切连接的方法不行，可以采用同源重组法试一试。目前就想到这么多 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2017-07-27 23:57:36
15623507725
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