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gongxj03

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达兔源糖蛋白求助

请有相关经验和知识的高手支招,

最近在表达兔源糖蛋白,用pPICZaA载体,转化了X33/KM71/SMD1168三个菌株,均产生大量阳性转化子,

但是SDS-PAGE检测蛋白含量和酶活测定结果显示蛋白分泌量少,酶活极低,请问各位有什么办法解决吗?

急求,谢谢。
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dellxiong

金虫 (初入文坛)

有做过抗生素筛选高拷贝菌株吗,(另,糖蛋白 需要糖基化修饰吗)
2楼2017-08-05 10:25:26
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HZAUAS

新虫 (小有名气)

3楼2017-08-08 11:52:33
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HZAUAS

新虫 (小有名气)

你测的是上清液里面粗蛋白的浓度,还是纯化出来的目的蛋白浓度;酶活是怎么测的,方法描述一下才可能给你提点建议

发自小木虫Android客户端
4楼2017-08-08 12:05:48
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gongxj03

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by HZAUAS at 2017-08-08 12:05:48
你测的是上清液里面粗蛋白的浓度,还是纯化出来的目的蛋白浓度;酶活是怎么测的,方法描述一下才可能给你提点建议

测的是上清液中的粗蛋白,用G250定量,上清中蛋白很少。酶活测定是加50ug底物,Tris-HCl(pH9.0,50mM),如果有酶活,底物被降解会产生黄色生成物,测OD。目测即可判断是否有活性,目前表达的菌株上清中都没有检测到酶活,
怀疑是产生了包涵体,想分离下酵母包涵体,请问有什么好办法吗?
5楼2017-08-08 13:01:56
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gongxj03

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dellxiong at 2017-08-05 10:25:26
有做过抗生素筛选高拷贝菌株吗,(另,糖蛋白 需要糖基化修饰吗)

加过抗生素筛选,但没有提高抗生素浓度,用的是常规浓度。
目前筛选到的菌株PCR鉴定都是阳性
6楼2017-08-08 13:02:55
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luckydog52

木虫 (著名写手)

自信源于一次次成功的积累
7楼2017-08-08 13:21:13
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gongxj03

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by luckydog52 at 2017-08-08 13:21:13
序列没优化吧

优化过了
8楼2017-08-08 13:42:39
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star013

新虫 (知名作家)


我们可以做优化的,也可以帮你表达纯化蛋白

发自小木虫Android客户端
9楼2017-08-08 14:33:27
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gongxj03

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by star013 at 2017-08-08 14:33:27
我们可以做优化的,也可以帮你表达纯化蛋白

免费?

发自小木虫IOS客户端
10楼2017-08-08 14:42:08
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