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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 毕赤酵母表达兔源糖蛋白求助
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gongxj03

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达兔源糖蛋白求助

请有相关经验和知识的高手支招，

最近在表达兔源糖蛋白，用pPICZaA载体，转化了X33/KM71/SMD1168三个菌株，均产生大量阳性转化子，

但是SDS-PAGE检测蛋白含量和酶活测定结果显示蛋白分泌量少，酶活极低，请问各位有什么办法解决吗？

急求，谢谢。
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1楼 2017-07-25 16:22:57
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dellxiong

金虫 (初入文坛)
有做过抗生素筛选高拷贝菌株吗，（另，糖蛋白 需要糖基化修饰吗）
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2楼2017-08-05 10:25:26
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HZAUAS

新虫 (小有名气)
可能目的蛋白被降解了

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3楼2017-08-08 11:52:33
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HZAUAS

新虫 (小有名气)
你测的是上清液里面粗蛋白的浓度，还是纯化出来的目的蛋白浓度；酶活是怎么测的，方法描述一下才可能给你提点建议

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4楼2017-08-08 12:05:48
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gongxj03

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by HZAUAS at 2017-08-08 12:05:48
你测的是上清液里面粗蛋白的浓度，还是纯化出来的目的蛋白浓度；酶活是怎么测的，方法描述一下才可能给你提点建议

测的是上清液中的粗蛋白，用G250定量，上清中蛋白很少。酶活测定是加50ug底物，Tris-HCl（pH9.0，50mM),如果有酶活，底物被降解会产生黄色生成物，测OD。目测即可判断是否有活性，目前表达的菌株上清中都没有检测到酶活，
怀疑是产生了包涵体，想分离下酵母包涵体，请问有什么好办法吗？
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5楼2017-08-08 13:01:56
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gongxj03

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dellxiong at 2017-08-05 10:25:26
有做过抗生素筛选高拷贝菌株吗，（另，糖蛋白 需要糖基化修饰吗）

加过抗生素筛选，但没有提高抗生素浓度，用的是常规浓度。
目前筛选到的菌株PCR鉴定都是阳性
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6楼2017-08-08 13:02:55
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luckydog52

木虫 (著名写手)
序列没优化吧

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自信源于一次次成功的积累
7楼2017-08-08 13:21:13
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gongxj03

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luckydog52 at 2017-08-08 13:21:13
序列没优化吧

优化过了
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8楼2017-08-08 13:42:39
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以做优化的，也可以帮你表达纯化蛋白

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9楼2017-08-08 14:33:27
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gongxj03

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by star013 at 2017-08-08 14:33:27
我们可以做优化的，也可以帮你表达纯化蛋白

免费？

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10楼2017-08-08 14:42:08
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