| 查看: 10185 | 回复: 29 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
浅谈蛋白纯化及制备过程中沉淀的形成
|
||||
|
Sample Text 蛋白发生沉淀的本质 1.蛋白质的水化膜遭到破坏或者中和了表面的净电荷后形成的沉淀往往是可逆的，这在蛋白盐析,蛋白等电沉淀中最为常见,利用这一特性也常用来纯化分离蛋白。 2.蛋白分子在遭到剧烈的物理化学(如高温,极端pH等)作用时，分子中的次级键遭到破坏断裂，导致空间构象从紧密有序的变为松散无序的状态,这种清况下形成的沉淀是不可逆的，蛋白发生变性。 对蛋白的生物活性进行检测即可判断是否可逆性沉淀 1.蛋白自身性质 如膜蛋白及一些疏水性高的蛋白就很容易发生疏水聚合而沉淀。这从我们做膜蛋白提取以及包涵体溶解时都有切身体会。 在表达还有二硫键键的蛋白时特别容易形成包涵体蛋白。所以蛋白的氨基酸序列中，含硫氨基酸较多时也容易形成沉淀。 2.pH值 蛋白质大多数都在高pH时溶解性高，低pH时易沉淀。这可能与氢键的形成有关。但有时候更低pH时蛋白又溶解了。这一现象在我们用亲和层析纯化抗体时特别常见。 3.盐浓度 就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。 4.有机溶剂 例子有丙酮沉淀。但有机溶剂也不是全部对蛋白起沉淀作用，有时候也有助溶作用。例如有些膜蛋白的有机溶剂抽提。 5.温度 高温或低温都有可能使得蛋白质沉淀。煮沸沉淀常见了，低温沉淀的例子有血液制品的冷乙醇沉淀。 6.表面活性剂 对蛋白质有助溶作用。例如做电泳的SDS就是很强的表面活性剂。还有TWEEN，Triton等等。 7.还原剂 还原剂往往对蛋白质有助溶作用。有些蛋白当加入的还原剂在空气中慢慢氧化后，就会沉淀析出。 8.变性剂 如尿素、盐酸胍。包涵体蛋白在用变性剂溶解后，再去除变性剂经常会沉淀析出。 利用可逆沉淀纯化蛋白 1.在蛋白质水溶液中，加入了高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等而使蛋白质从溶液中析出，称为盐析。 2.在确定蛋白的pI后，用弱酸/弱碱（如碳酸钠等）缓慢滴加到蛋白溶液中，使溶液pH和pI一致，即可沉淀出目标蛋白，称为等电沉淀。 避免不可逆沉底的发生 1.对温度敏感型蛋白的纯化制备尽可能在4度的环境中进行。 2.蛋白溶液在透析脱盐时尽可能的避免体系剧烈变化，可梯度透析。 3.亲和层析纯化蛋白时，大学需要较低的pH洗脱，在收集洗脱峰的容器中垫缓冲液，让洗脱下来的蛋白迅速恢复到中性环境。 4.总而言之，在蛋白纯化及制备过程中，选择温和的操作环境，换缓冲液等过程要缓慢，避免剧烈操作。另外在制备过程中也可以尝试加一些增溶剂，尿素，精氨酸等。也可尝试加还原剂DTT，B-ME等。也可以加EDTA避免蛋白的降解。 处理沉淀 1.发生可逆沉淀后，我们可以尝试通过增加溶剂，调节pH，添加助溶剂等方式来处理。 2.若发生不可逆沉淀，可以选择离心，过滤等方式去除。 生物制药合伙人（齐聚力量，助力发展） 欢迎留言批评指正并分享您宝贵的经验，谢谢！！  55.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 有价值的生物经验贴 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
547star» 猜你喜欢
急需调剂
已经有9人回复
-
申博/考博
已经有4人回复
-
化工学硕294分，求导师收留
已经有37人回复
-
求调剂
已经有11人回复
-
260求调剂
已经有4人回复
-
一志愿华中农业071010，320求调剂
已经有19人回复
-
304求调剂
已经有7人回复
-
求博导｜生物质基多孔碳/超级电容方向，已有相关成果，寻能源材料/碳材料方向老师
已经有3人回复
-
二苯甲酮酸类衍生物
已经有6人回复
-
接受任何调剂
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
燕山大学亚稳材料全国重点实验室2026年博士研究生招生信息
+1/84
-
长江大学化工学院环境学硕、专硕最后一批调剂（理学、工学均可，线上面试）
+1/83
-
还有名额！！辽石化新材料学院材料专业调剂 理转工 / 学专互调
+1/40
-
山东航空学院安全工程专业085702第三轮接收研究生调剂，欢迎咨询
+1/35
-
上海交通大学-电气工程学院-高温超导磁体-2026年入学全日制博士生招聘
+1/34
-
武汉纺织大学学硕调剂
+1/17
-
河南省医学科学院王宁利院士/苗彦彦研究员科研团队、伏羲慧眼云平台团队2026年博士、�
+1/12
-
上海交通大学材料成形（塑性加工）常年招聘硕士研究生、博士研究生和博士后
+1/10
-
湖北文理学院物理与电子工程学院材料与化工专业研究生调剂
+1/10
-
复试调剂-招收调剂生（一志愿07开头专业），海洋生物专业4个名额
+1/9
-
C13、N15标记植物，助力土壤碳氮循环与地学研究实操
+1/8
-
接收资源与环境专业硕士调剂
+1/8
-
中国农业大学资源与环境学院 - 招聘杰出人才、青年研究员、优秀人才和博士后
+1/5
-
[MPhil全奖招生] 香港科技大学（香港）| 天线设计/RF集成系统 | 26F/27S
+1/4
-
坐标南京
+1/3
-
2026年中国劳动关系学院环境与资源（安全工程领域）专业硕士研究生调剂复试（第三轮）
+1/3
-
[MPhil全奖招生] 香港科技大学（香港）| 天线设计/RF集成系统 | 26F/27S
+1/3
-
北华大学—工学08调剂仍有余额（初试需含数学+英语）
+1/2
-
【每日皆可乐】探秘细胞因子：趋化因子家族解析
+1/2
-
易度质量流量控制器，火焰处理工艺中燃气精准控制与安全保障
+1/1
27楼2018-04-10 15:12:09
简单回复
2017-07-14 11:18
回复
hc-material(金币+1): 谢谢参与
gl 发自小木虫Android客户端
凤妹6月13楼
2017-07-14 11:45
回复
