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重组木聚糖酶酶谱
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分离胶中添加0.1%的高粘度阿拉伯木聚糖（我做的酶最适底物），采用标准SDS-PAGE电泳(12%的分离胶和5%的浓缩胶，浓缩胶时电压为8 V/cm，当跑至分离胶时电压改为15 V/cm直至电泳结束)后，用适量2.5 %Triton X-100洗脱SDS每20min，更换2.5 %Triton X-100漂洗3次，再用0.2M磷酸缓冲漂洗3次每次15min；于加入适量0.2M磷酸缓冲4℃复性12h;于37 ℃保温12 h，0.1%刚果红染色10 min更换染色液染色大概30min；最后用1 mol/L NaCl脱色直至出现清晰的亮带。 酶液添加10μL，上样缓冲液分别为 1. 2X上样缓冲液：100 mM Tris(pH6.8),200 mM DTT,4%SDS,0.2%溴酚蓝，20%甘油。 2. 2X上样缓冲液：100 mM Tris(pH6.8),4%SDS,0.2%溴酚蓝，20%甘油。 3. 2X上样缓冲液：100 mM Tris(pH6.8),4%SDS，200 mM DTT,20%甘油 4.Zymogram Sample Buffer:1 M tris-HCl (pH 6.8) 0.625mL、甘油2.5mL，20％ SDS 2mL，0.1％溴酚兰 1.0mL 5.2x Laemmli Sample Buffe:1 M tris-HCl (pH 6.8) 1.25mL、甘油2mL、20％ SDS 2mL、0.1％溴酚兰 0.4mL、2-巯基乙醇 1mL，双蒸水至10mL。 我有查过刚果红pH在3.5-5.2，酸性条件下呈蓝紫色，由于复性时用的0.2M磷酸缓冲液偏酸（我的酶最适反应pH）,所以在脱色后又加入适量0.2 MNaOH（第二张图）。 我第一次做酶谱，想请教各位，我的实验步骤和操作有什问题？ 谢谢  IMG_1628.JPG  IMG_1628_副本.jpg |
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