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huadsh

铜虫 (小有名气)

[交流] 酶活力测定方法的问题

青霉素酶活力的测定方法中,
  酶活力测定法
  青霉素溶液
  称取青霉素钠(钾)适量,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。
  青霉素酶稀释液
  取青霉素酶溶液,按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0) 稀释成每1ml中约含青霉素酶8000~12 000单位的溶液,在37℃预热。
  测定法
  精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中,预热至37℃后,精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml,迅速混匀,在37℃准确放置1小时,精密量取3ml,立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)[精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml,置100ml量瓶中,用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定,至近终点时,加淀粉指示液,继续滴定至蓝色消失。
  空白试验
  取已预热的青霉素溶液2ml,在37℃放置1小时,精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml,然后精密加青霉素酶稀释液1ml,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算:
  E=(B-A)×M×F×D×100
  式中
  E为青霉素酶活力,(单位/ml)/小时;
  B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;
  A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;
  M为硫代硫酸钠滴定液的浓度,mol/L;
  F为在相同条件下,每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的单位数;
  D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

在37℃放置1小时,是否是硬性规定,为什么?我在测定中发现:随时间延长,活力越来越高?为什么?这时应该以哪个为准?请高手援助.
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心,不没于物


lwf991229(金币+1):感谢参与讨论,欢迎常来~ 1-18 14:50
因为你的底物是过量的,酶反应一小时被不会失活,当然是时间越长产生的产物越多值越大了。后面的“用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释”主要目的是终止反应,因为pH4.5下酶活很低。
下次测酶活时记得一定要方法标准化,最好还做下标准曲线。
《memory》---BarbaraStreisand
3楼2009-01-18 14:30:50
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112976553

金虫 (小有名气)

测酶活现在也有试剂盒了,价格也不贵,你查下看看,我做的GSH-PX用的是南京建成公司的试剂盒,不过关于青霉素的我不太了解。提个意见
4楼2009-01-18 15:25:05
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