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Catherine92金虫 (小有名气)
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[交流]
实验室建设——临床分子病理基因检测实验室
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近年二代基因测序（next-generation sequencing，NGS）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。 一、实验室总体要求 NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》进行。 1.NGS检测人员的资质要求： 应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过NGS技术的理论与技能培训合格。数据分析人员应具有临床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（医学博士学位或高级职称）审核。 2.NGS检测实验室的区域设置要求： 原则上NGS实验室应当有以下分区： 样本前处理区、 试剂储存和准备区、 样本制备区、 文库制备区、 杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）、 文库扩增区（第二扩增区）、 文库检测与质控区、 测序区、 数据存贮区。 各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开。 3.NGS检测试剂及项目要求： 试剂和测序平台均应选择中国食品药品监督管理总局（CFDA）认可产品。涉及到实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（SOP），需经过临床实验室自建项目（LDT）验证合格才可使用。每个NGS检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类型包括，单碱基突变single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷贝数变异Copynumber variations（CNVs）、染色体结构变异，structuralvariation（SVs）以及不同的样本类型（如FFPE组织、新鲜组织、全血、胸水等）对特定panel的准确性、精确性、敏感性、特异性等性能参数进行LDT验证。应该有经过标准品测试的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同测序深度的灵敏度及特异性数据，确定不同样本的可信的测序深度。经验证后，SOP发生的任何改动，包括试剂、仪器、基因项目等都需要重新做验证。验证实验结果签名留底备案。 4.NGS检测实验室的质量管理要求： NGS检测主要包括实验操作和生物信息学分析两部分。 实验操作部分包括样本准备、文库制备、编码（barcoding）、目标区域富集、测序等； 生物信息学分析部分包括定位（mapping）、比对、变异识别、变异注释、变异解读及报告等。 上述流程均需要建立实验室质量管理体系文件和SOP及机器运行和维护SOP，具有严格的室内质控措施；定期参加室间质评以有及持续的质量保证和改进计划。 二、NGS检测流程中的质量标准 1.核酸提取及其质量分析： 提取的核酸质量是NGS检测成功的关键因素，在制备文库前应采用多种方法对核酸质量评估，包括纯度、浓度和完整性分析。需要根据不同的样本类型制定相应的SOP用以鉴定核酸的纯度、浓度、完整性或降解程度等。并对应明确接受和拒绝的标准。 2.文库制备及其质量分析： 文库制备方法主要有杂交捕获和扩增子建库，无论采用何种方法制备文库和平台检测，都应对检测基因、区域或突变热点进行描述，并建立实验室检测SOP。建立好文库后上机测序前需对文库进行质量分析。每个检测项目应设定其文库质量的要求，明确接受或拒绝的标准。 3.NGS测序仪上机分析及其质量分析： NGS建库主要有扩增法和捕获法两大策略，测序时根据检测样本量和质量要求确定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。录入样本编号、检测内容、设定参数等信息，按仪器操作流程进行测序。产生的测序数据质量参数要求详见后文。 4.NGS检测中的样本追踪及对照设置： （1）样本追踪：为确保检测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个SNV位点或其他标签作为样本身份标识（sample ID），在检测前对每个样本进行SNV位点信息的测定，在NGS检测后对上述位点进行追踪，证明没有交叉污染。 （2）阳性对照：应用组合型质控材料，可采用已知突变信息的混合样本，以模拟样本的复杂性。实验时同时检测，以确保其检出能力。 （3）阴性对照：用无核酸或明确无突变的样本作为模板同时进行检测，以确保检测过程中没有污染或非特异性。 （4）应对方案和替代方法：各个质量控制步骤中如出现异常或失败，实验室应有应对措施或备选方案；对于测序结果质量差或有问题的区域应建立替代方法（如Sanger测序）。 |
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 生物医药操作规程 |
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