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活肿瘤组织冻存复苏技术常见问题解答
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活肿瘤组织冻存复苏技术常见问题解答 2017年5月27日 原理篇 1.可以冻存什么类型的肿瘤组织？ （1）患者的正常组织、癌旁组织、肿瘤组织，可以是穿刺取材的组织，也可以是手术取材的组织。（2）模式动物传代的肿瘤组织。 2什么是玻璃化冻存？ 水冷冻时，会产生冰晶，冰晶会损伤细胞、组织、器官的活性。因此，好的冻存技术要抑制、杜绝冰晶的形成。玻璃化和非玻璃化冻存的区别在于——液态水是否为极速降温以至于无法形成冰晶。传统、经典的冻存技术是非玻璃化冻存，先将冻存的样本降温至-80℃，可以抑制细胞内大冰晶的形成，但是不能杜绝。玻璃化冻存是将液态水直接变成玻璃化固态（glass state）,而不可能产生冰晶，这个过程是在极短时间内发生的。 3.为什么选择玻璃化技术冻存组织？ 经典非玻璃化冻存最适合处理单一类型、均匀的细胞悬液。组织中的细胞类型差异很大，分布不均匀，为多层细胞，且含有细胞间质，用非玻璃化冻存难以达成均匀降温、均匀被经典冻存液渗透的效果。 4.玻璃化组织冻存和复苏的关键是什么？ 极快速的降温和极快速的升温，只有两个温度——室温/37℃、-135℃以下。即操作过程中，组织要快速移入、移出液氮，并且要在液氮上操作。 5.细胞冻存通常要求冰上或4℃操作，为什么肿瘤组织冻存说明书上要求26℃处理？这样会对组织造成损伤吗？ 冻存液中的冷冻保护剂对细胞活性有一定损伤。如果温度太低，虽然毒性作用小，但是冷冻保护剂渗透速度太慢而需要更长的处理时间。如果温度为37℃，虽然渗透速度快，但是毒性作用大。因此选择合适的冷冻处理时间和处理温度能够将这种损伤减少到最低。我们选择26℃是因为在这个温度下，冻存液中的冷冻保护剂在相对短的时间内能够快速渗透到细胞和组织间隙中。 6.为什么要使用刀片和切片工具处理组织？ 穿刺组织不需切片处理，而手术组织由于大小差异显著，需要做标准化、均一化切片，这样最大程度保存组织活性，使结果稳定、可靠。 7.哪些因素会影响冻存的组织活性？ 如手术时间是否太长、麻醉剂的使用、取材后组织是否搁置太久、是否按说明书的细节严格操作、保存中是否规律性检查液氮罐。 8.来源于患者的冻存、复苏后组织接种PDX模式动物的成瘤率如何？ 采用相同的操作、接种方法，与新鲜组织的成瘤率相近，成瘤所需时间会稍晚。 操作篇 1.组织冻存前应该做怎样的鉴别和处理？怎样保存？传代的组织疏松 不同类型、不同患者来源的肿瘤组织和癌旁组织特性可能有很大的差异。对于手术组织，处理前先检查组织是否易成碎渣。如果不是，按说明书标准操作处理；如果是，建议使用LT2603和LT2604测试一次切片处理，如果组织可以切成形态较完整的1mm组织片，可以使用本产品，如果无法切成形态较完整的1mm组织片，不推荐使用本产品。对于穿刺组织，则不需切片，尽量选择形态完整、不太碎的。对于手术组织，应修剪血块、血管，用生理盐水或PBS溶液清洗后再切片。对于某些可能存在污染的组织，比如结直肠癌组织，应用含抗生素的生理盐水或PBS溶液充分润洗3次后再切片。 2.为什么要求使用无菌液氮？ 为了防止不同组织样本间的交叉污染和外源微生物污染。当处理的组织样本可能携带已知或者各种未知的病原体时，应当严格区分操作过程中使用的各种耗材，包括液氮。另外，不洁净的容器和耗材以及操作者的不慎也非常容易将外源微生物引进液氮和待保存样本中。如果使用气相液氮罐，并且操作过程中严格遵循无菌操作，液氮容器（液氮杯、液氮碗）已做无菌处理或者购置了液氮除菌机，可避免上述潜在问题。 3.怎样得到无菌液氮？ 只有炭疽杆菌这样的微生物可能在液氮中存活，所以液氮本身的微生物污染几乎是外源的。无菌液氮可以通过专用机器制取，如果预算充足，可购买便携式小型无菌液氮处理机。您也可以注意以下操作细节，可避免液氮的污染：（1）液氮存储容器，如液氮罐、液氮杯、冻存架、冻存盒，使用前用医用酒精处理，也可以用其它消毒剂，用灭菌水清洗后晾干，或者在253.7nm紫外线下辐照15分钟；（2）使用无菌冻存管，保障操作过程中的无菌环境。（3）冻存管入液氮后由于收缩，有少量液氮会进入冻存管内，可使用气相液氮罐，避免交叉污染。 4.V1、V2处理至少需要40分钟，怎样提高效率或者减少操作时间？ 对于手术标本，可以每次轮流处理2~4个标本，在等待V1、V2时，依次切片不同样本，这样可以缩短样本平均所需处理时间至30分钟以内。对于穿刺样本，可以每次同时处理2~4个标本，V1、V2处理时间分别缩短为10分钟、6分钟，样本平均所需处理时间非常短。 5.怎样确定V2处理时间？ 不同组织的细胞和组织间隙构成有差异，这导致V2处理时间的差异。通常同一类型的 正常组织或者肿瘤组织处理时间是一致的。V2处理15分钟后，如果组织仍未能自然沉降至管底，毋需等待更长时间，应终止，接着进行下一步操作。 6.怎样把组织支架放入冻存管中？ 在冻存管上标记保存的组织信息后，拧开冻存管盖子，用镊子夹住冻存管中上段，置入液氮杯中预冷，注意不要将管口浸入液氮，以免复苏时管内大量液氮快速升温引起爆裂。预冷5秒钟后，用另一把镊子夹住组织支架的一端，即可放入冻存管中，注意应在液氮上操作，避免升温破坏玻璃化冷冻效果。最后，快速拧上管盖，注意不可过紧，以免复苏操作时，由于难以拧开管盖而影响快速升温。 7.组织切片模具和刀片能重复使用吗？怎样消毒？ 组织切片模具可以重复使用，可以用75%酒精浸泡并晾干后使用，也可以浸泡后去离子水冲洗，高压灭菌后再使用。刀片为无菌分装一次性使用。 8.有些手术组织非常有弹性，不容易切片怎么办？ 按照我们的教学视频，通常需要2个刀片固定肿瘤组织。如果由于组织弹性太大而不容易固定，可以用3个刀片固定，或者将组织切割成更小体积，再用刀片固定。 9.组织支架怎么使用？ 作为支持物，便于将组织转移到冻存管中。仅在液氮处理前将组织转移到支架上，再浸入液氮。液氮降温处理后的组织会固定在支架上，不需取下，直接移入冻存管。 10.待液氮处理的组织怎样放到组织支架上？ 对于穿刺组织，可用一次性巴斯德吸管将条状穿刺组织用少量V2液体轻轻吸上，转移到支架上，注意不要折叠或者过度弯曲组织，用平头镊将组织拨成线段状平铺在组织支架上。对于切片的手术组织，注意组织片的外缘不要超过组织支架，以免无法放入冻存管，也用平头镊将组织平铺在支架上，不可层叠和折叠，以免影响玻璃化冻存效果。 11.T1溶液复苏时为什么要摇一摇？ 有利于冻存组织快速、均匀地升温。摇动后，组织也会从支架上脱落。 12.说明书中冻存管要先预冷，再把组织支架放到冻存管中。是否可以先把组织及组织支架放入冻存管后，再把冻存管放入液氮中急剧降温处理？ 不可以，请严格按照说明书操作。冻存管的热传导效率差，不能达到玻璃化冷冻要求的急剧降温速度。 13.为什么组织支架要在液氮中浸润5分钟以上？ 为了使组织在液氮中降温充分和均匀。 14.液氮冷冻处理后的组织能放到-80℃冰箱后，再转入液氮罐吗？ 不能。液氮冷冻处理后的组织<-135℃是玻璃化冷冻状态，如果放到超低温冰箱，造成温度上升，组织细胞内会形成冰晶，造成组织坏死，不能继续使用。 |
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