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bluelz_2001

银虫 (初入文坛)

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[交流] 奇怪的现象：pet28质粒双酶切线后电泳，比环状的跑的还快

在用pet28a做重组表达
提取了pet28a空载的质粒后，用EcoR I和Sal I做双酶切
发现空载质粒双酶切后，反而比未切的对照跑的快
做50 ul和20 ul酶切都出现了这种情况，就用10 ul体系做了双、单酶切效果的对照

图中是10 ul体系，EcoR I和Sal I双酶切和单酶切后的电泳图
Lane 1: pet28 空载质粒（未切）
Lane 2: pet28 质粒EcoR I和Sal I双酶切
Lane 3：pet28 质粒EcoR I单酶切
Lane 4：pet28 质粒Sal I单酶切

双酶切体系是
10 ul
质粒 3 ul
10*H缓冲液 1 ul
EcoR I 0.5 ul
Sal I 0.5 ul
水 5 ul

单酶切体系是
10 ul
质粒 3 ul
10*H缓冲液 1 ul
EcoR I 或 Sal I 0.5 ul
水 5.5 ul

划板-摇菌活化-提质粒-酶切-电泳，重复了多次，电泳出来的效果都是这样，而且用双酶切后回收的质粒与我的目的基因连接转化，虽然kana抗性的平板上长出了克隆，但筛选不出阳性的。另外，EcoR I和Sal I购自takara,从pMD克隆载体上切我的目的片段没有问题。

还请大家帮忙给分析一下，多谢多谢！！

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