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shipeng001

银虫 (小有名气)

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[求助] 链霉菌与ET12567（pUZ8002）接合转移问题求助已有4人参与

现在研三，一直在用ET12567（pUZ8002）做链霉菌的接合转移，研一研二做的好好的，整合型载体（如pJTU824，pSET152）能长满板，用fosmid做敲除也能长10个左右接合子；可就是后来怎么做都不成功，整合型载体都做不进去了，真是见鬼。。。想问问虫友们有没有类似的经历，或是有什么好的解决办法。
   我们实验室使用TES热击后，加2*孢子萌发液，30 ℃预萌发的；我也试过用2*YT，可效果还是不理想。
(1)TES缓冲液：0.05M  PH8.0
(2)2X孢子预萌发培养基：酵母膏，1%；酪蛋白氨基酸，1%；CaCl2,0.01M

1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接到5 mL含50 ug的Apr、卡那和氯霉素的LB中， 37 ℃，200 r/min培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 1 mL的LB悬浮，备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发
(1)制备浓的孢子悬液
(2)新鲜孢子悬浮于2 ml  0.05 M PH8.0 的TES;
(3)50oC水浴热激10分钟;
(4)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(5)37oC摇床分别培养2-３小时;
（6）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
（7）在振荡器上打散孢子
5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀
6.  30oC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖
7.  30oC培养数天（一般2-3天）可得到接合转移子.
8. 挑选接合转移子PCR验证;

还请大家不吝赐教，感谢。

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1楼2017-05-30 10:57:33

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菁酱

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我正准备开始做??帮顶

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2楼2017-09-26 20:37:22

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In_vain

银虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

1、第五步，我都是用28℃恢复培养的，为什么你这里用的是37℃呢？
2、你用的孢子是新鲜的孢子吗？因为我最近发现孢子放在-20冰箱一段时间做的接合转移长的接合子就很少，之前的孢子是放在-80的，做的就长的很多。
3、第八步，你的接合子直接进行了PCR验证？没有纯化接合子吗？如果有请问你是怎么纯化的呢？

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7楼2018-06-11 11:13:44

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