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1. 对于贴壁细胞或细胞涂片： a. PBS或HBSS洗涤一次。 b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c. 用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。 d. 用PBS或HBSS洗涤一次。 e. 加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟。 f. 转步骤5。 2. 对于悬浮细胞或细胞悬液： a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。 b. 用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。 c. 用PBS或HBSS洗涤一次。 d. 用含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，室温孵育5分钟。 e. 转步骤5。 3. 对于石蜡切片： a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。 b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37o作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。 c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 d. 转步骤5。 4. 对于冰冻切片： a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。 b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。 c. 加入碧云天生产的免疫染色强力通透液(P0097)或含0.5% Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟。 d. 转步骤5。 5. 配制TUNEL检测液：参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。 1个样品 5个样品 10个样品 TdT酶 2ul 10ul 20ul 荧光标记液 48ul 240ul 480ul TUNEL检测液 50ul 250ul 500ul 6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片： a. 用PBS或HBSS洗涤2次。 b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37o避光孵育60分钟。注意：50μl TUNEL检测液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一个孔，如果是6孔板中的一个孔TUNEL检测液宜使用100μl。如果待检测的样品为涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL检测液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL检测液蒸发，并且使TUNEL检测液均匀覆盖样品。自行裁剪圆片时需要连着圆片突出一个角或连着一条，并将圆形之外的突出部分折叠，方便染色结束后利用突出部分顺利取出圆片。也可以用PAP Pen圈出一个区域进行染色。孵育时需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润，从而尽量减少TUNEL检测液的蒸发。 c. PBS或HBSS洗涤3次。 d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。 7. 对于悬浮细胞或细胞悬液： a. 用PBS或HBSS洗涤2次。 b. 加入50μl TUNEL检测液，37o避光孵育60分钟。 c. PBS或HBSS洗涤2次。 d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。 e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。 |
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