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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RNA提取
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bravexu

金虫 (小有名气)

[交流] RNA提取

最近用生工的RNA提取试剂盒提取水稻籽粒中的RNA。按照生工的说明书进行操作。在加入0.1ml氯仿/异戊醇后，按照说明书用12000rpm离心5min，管中层见白色絮状沉淀，上清的量很少或没有（protalk上说大约有0.45ml上清，但我提的时候一般只有0.1ml左右的上清），继续按照protalk上的步骤做下去，RNA的浓度很低或者没有。请问哪位高手能给我指点一下，谢谢了!
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1楼 2009-01-08 16:12:18
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daixin8121

★
bravexu(金币+1,VIP+0):谢谢
应该是蛋白质含量较高，先加缓冲液粗提以后，在加蛋白酶K和DTT在42度下100r/m温和摇床1个半小时
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3楼2009-01-08 19:25:07
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小小木虫8580

金虫 (小有名气)
★
bravexu(金币+1,VIP+0):谢谢
估计是水稻籽粒的多糖含量太高吧，
在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。
也可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。
也可能是蛋白过多，先用蛋白酶硝化一下再用氯仿/异戊醇抽提
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2楼2009-01-08 16:26:43
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
bravexu(金币+1,VIP+0):谢谢
奉劝你还是不要用试剂盒了，成本低，售价高，有的还骗人，用传统的方法做就可以了。种子的蛋白和多糖杂质比较多，可以用无水乙醇浸泡液氮研磨的种子，低温保存24小时，然后离心去上清，可以去掉多糖杂质。
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会当凌绝顶，一览众山小
4楼2009-01-08 23:44:03
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pinene3862

银虫 (正式写手)
★
bravexu(金币+1,VIP+0):谢谢
同上。试剂盒拿来提种子这样高淀粉材料的RNA不行的。用传统方法比较好。你实验里中间层应该就是淀粉这一类的东西。
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5楼2009-01-09 00:22:59
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