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Catherine92

金虫 (小有名气)

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[交流] 扒一扒测序仪的工作原理已有7人参与

国外的技术创新可谓源源不断，像比如Joe Jacobson大神原本是搞物理的。他发明了e-ink，没错就是kindle上那个e-ink，那时候他还是本科生……不久后他的公司Gen9率先搞出高通量DNA合成技术……基因技术玩的就是跨界！（智商受到碾压）

好在咱国内起步不低，华大基因通过海外收购+研发的方法也整出了自己的高通量测序技术，不管有人怎么冷嘲热讽，始终是零的突破，汪老师魄力可见一斑。

生物或许又是一个我国可以与美帝平起平坐的行业，而这其中首当其冲就是测序技术。搞不定测序技术的国产化，很多应用始终要受制于人，相信很多搞生物的小伙伴们一定深有体会。11年华大买完测序仪illumina就给测序试剂坐地起价的事情至今还历历在目，不自己搞测序能行么？

那么今天，就来把测序仪的原理以接地气的方式八一八！

首先，神马是测序呢？顾名思义，测序（sequencing）就是测量出一段序列的意思。广义的测序不仅仅包括了DNA的测序，还包括蛋白、RNA等等别的物质构成的序列。你可能会问，我有一串黑白珍珠项链，数一下顺序算不算测序呢？……那必须是算的！

这是一串黑白珍珠项链，我们仔细观察，会发现这中间包括两种基本单元：黑珍珠和白珍珠。要搞明白它的序列要怎样去测呢？答案很简单：用肉眼看（坑爹呐），因为这是简单经济的方法。对于这串项链的序列我们可以作如下的表示：
WWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWB

WWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBWWBR(连接环)BBWWB……

其实这个过程与DNA测序如出一辙——它们的目的是一样的，只是对DNA进行测序，要求我们去观察一个物理尺度远小于这串项链的长长的分子，由四种基本单元组成（连接了ATCG四种碱基的核苷酸），表示一下就是：
……GAGCGGATAACAATTTCACACAGG……

这个分子有多小呢？构成这个分子的每个最小单位（核苷酸）只有大约0.34纳米。它有多长呢？以我们的人类基因组为例，一个染色体里面的DNA序列动辄有一两亿个碱基对。（似乎比数项链复杂很多呢）

但这还没完，这条长长的分子还会扭曲折叠在一起（想象一下口袋里面团成一团的耳机线），这样细微而复杂的结构，想通过传统的光学手段进行直接观测是几乎没有希望的（远小于可见光的波长）。那电镜可不可以呢？且不说当年的电镜技术，就算是到了今天，心血来潮看个局部还行，用来测序根本不具备可操作性。

所以在当时来看，DNA测序完全是Mission Impossible！（说了半天什么都没说啊摔）

Against all odds, 生物学家们终于想到了用来测序DNA分子的办法，而且不止一种。

最早实现的方法就是双脱氧终止反应法（所谓的Sanger测序）。这种方法是怎么测序的呢？也是用肉眼看！没错，Sanger先生在70年代就成功地将DNA序列碱基差异带来的微弱信号放大到了肉眼可见的级别，堪称信号放大的奇迹。

我们继续以珍珠项链为例：

假设我是瞎子，而每个珍珠摸上去都一模一样，我该如何弄清楚珍珠项链的顺序呢？好在我很幸运地拥有一个项链复制机（DNA聚合酶）可以帮我复制珍珠项链，只不过复制出来的颜色是反着的。而我又有一包穿孔的黑珍珠和一包穿孔的白珍珠可以为机器提供复制的原材料。现在我能不能搞清楚珍珠项链的顺序了呢？Sanger先生的办法是这样的：
把白色的穿孔珍珠中间挑出一小部分，把一侧的孔给堵住，做成一侧有孔的白色珍珠。若是复制机在本来该串白色珍珠的地方串到一个一侧有孔的白色珍珠，就会停下来不再继续。
把模板珍珠项链、黑白穿孔珍珠和一侧有孔的白色珍珠全部提供给复制机，机器就会不断复制出不完整的反色项链。

这样我得到了很多不完整的项链片段，它们有两个共同点：一端都一样，另一端都是白色的。我数一下这些片段的长度，可以得到这样的信息：
W
???W
??????W
?????????W
……
仔细分析，这些信息已经够我推测出原本的项链排列是：B??B??B??B…了，考虑到这个项链只有黑白两色，我可以不用换堵黑色珍珠的孔再做一遍实验就可以得知原本的项链是BWWBWWBWWB…的序列了。

Sanger法进行DNA测序也是一样的，无非是拥有四种颜色的珍珠项链，具体方法大家脑洞一下即可。

至于上面所说的“数数”的过程是通过电泳（electrophoresis）的方式实现的。简单来说就是在一个“泳池”里面让DNA片段“赛跑”，片段越长“跑”得越慢，去一个合适的时间，不用等所有片段都“跑”到终点，停下来显像，根据看到“条带”的位置就可以反过来推测相应DNA片段的长度了。

至于怎么让DNA“跑”起来嘛，因为DNA分子带有一定的电性，给“泳池”加上一个恒定方向的电场就可以了。

生化测序按照代际来分：
一代测序（Sanger测序法，本质上都和上面数珍珠项链的方法是一样的）
二代测序，普遍具有高通量的特点。
SBL（Sequence by Ligation）：SOLiD、华大Revolucity（前CG）等等
SBS（Sequence by Synthesis）：illumina 全系列（前SOLEXA）、华大BGI-Seq 500（未量产）、Ion Torrent PGM、Ion Proton™、Roche 454等等
三代测序，普遍具有单分子、近乎实时的特点。
SMRT™：PacBio旗下测序仪
Nanopore（未商用）：Oxford Nanopore MinION（u盘大小测序仪，刚有原型机，可惜准确率太低）、Genia（George Church大神力荐，已被Roche$125MM重金收购，希望不要被毁掉），还有illumina自家的三代测序技术目前还很神秘。

说到二代测序的原理无外乎是分为如下几个步骤：
将待测序DNA片段化，经过特定的处理以符合相应测序平台的输入要求，此过程称为建库。
上样，（在机器内）通过特殊的PCR反应过程将待测片段原位（in situ）扩增。
（在机器内）通过对DNA反应过程进行变量控制（时间、空间），并捕捉此过程中释放出的相应的（因扩增而变得可观测的）信号。这些信号可以是荧光信号（illumina、454、华大CG等）或是释放质子所引致的局部酸碱变化（Ion Torrent）。
计算机采集数据，并进行组装（将片段还原成长序列）。
顺便说一句，二代测序又被成为NGS（Next Generation Sequencing，次世代测序），十年前被用于区分一代测序。鉴于现在二代测序已经广泛使用而一代测序濒临淘汰，很多人将NGS重新解释为“Now Generation Sequencing”。

有关三代测序是这样的：
实际上目前唯一已经商用的三代测序技术是PacBio的SMRT™技术：不同于nanopore的直线穿过，SMRT将DNA分子连成环后不断测序以解决准确率低的问题。具体方法非常精彩，限于篇幅有限不再多说，有兴趣的同学可以自己去查找资料。

除此之外还有另辟蹊径的，例如使用MALDI-TOF，实际上是一个质谱……

以及一些脑洞大开的方法，例如上次在MIT和大牛Joe Jacobson聊天的时候他随手扔给我一个“重复单分子杂交核酸测序（Nucleotide sequencing via repetitive single molecule hybridization）”的专利，说这玩意可以让重测序低至1美元。。

本质上是通过在一块CMOS板子上排列所有可能的n-mer DNA做adaptor，再把目标序列打成极小片段通过杂交获取信号后再用数学方法运算而实现。

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