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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教连接后酶切验证的有关问题
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足下客

木虫 (正式写手)

[交流] 请教连接后酶切验证的有关问题

我用pUC19构建了一个载体，连上的片段大小应该为2.8kb,已经做了PCR验证，结果呈阳性，可是单酶切过后片段大小不符合，大约只有4kb。预期大小应该将近5.5kb。
请问大家有没有碰见过这种情况，以前做完酶切后，也有大小不准的现象，不知道是什么原因造成的。同学说可能是我的1 kb ladder或是核酸胶的问题。
希望知道原因的虫友们赐教
非常感谢！
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1楼 2009-01-04 14:42:09
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figo.339

木虫 (著名写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0): 感谢参与讨论~
超螺旋，线性，开环DNA在电泳中跑的快慢的问题。
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2楼2009-01-04 22:25:46
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mascotte

金虫 (正式写手)
可以查查看连接后的重组体中是否不止一个你所用酶的酶切位点。
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3楼2009-01-04 23:06:42
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足下客

木虫 (正式写手)
我连上的片段中没有我用的酶的酶切位点
与酶切之前的质粒做对照，已经切成线性的了，可是大小与我的预期不一致。但是PCR验证表明我的片段是连接上了的
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4楼2009-01-05 14:28:23
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MAIZE

用质粒做对照是很难的，你选择两个酶切位点，用你连入的酶切位点酶切，只要前面割胶回收控制得好的话，根据我的经验一般不会出问题，我最近一个多月连了9个载体均正确，分别PCR，酶切，测序验证。另外重新分析你基因内部和载体上的酶切位点。
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5楼2009-01-05 15:21:25
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Alexis

铜虫 (小有名气)
分析酶切位点，选择双酶切鉴定一下
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6楼2009-01-10 21:28:09
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
你至少应该测序，看你的判断正不正确，再做酶切的啊
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帮助虫友，提升自己
7楼2009-01-10 21:35:55
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