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熙源羊羊羊

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[求助] PCR总是p不出来啊，大神们求助已有5人参与

PCR总是p不出来，图中是体系跟程序，有时候配了4管一模一样的，只有一管有目的片段，后来再p一管也p不出来，稀释了模版十倍，20倍，，也没用，酶la taq..primer star 都试过，摸过梯度，现在一筹莫展。。

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1楼 2017-04-17 16:11:55

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匿名

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3楼2017-04-17 17:33:59

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shenshou167

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是不是仪器的原因？

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4楼2017-04-17 20:54:09

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shenshou167

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按道理一模一样，可能就是仪器的问题

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5楼2017-04-17 20:55:03

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jukongka

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【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-04-19 07:46:06

1. 首先要确定你的引物设计的没问题，因为基因组上突变不较多，如果引物太短很有可能影响扩增效率，可以适当加长引物长度，或者用兼并引物；
2. 保证基因组DNA提取的纯度，这个很重要，然后是完整度；
3. 如果做过退火梯度还不行，可以试一下touchdown PCR；
4. 考察一下这段基因组DNA的GC含量，如果太高，换用LA Taq的GC buffer

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6楼2017-04-18 10:23:40

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熙源羊羊羊

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1楼: Originally posted by 熙源羊羊羊 at 2017-04-17 16:11:55
PCR总是p不出来，图中是体系跟程序，有时候配了4管一模一样的，只有一管有目的片段，后来再p一管也p不出来，稀释了模版十倍，20倍，，也没用，酶la taq..primer star 都试过，摸过梯度，现在一筹莫展。。

...

模板用的小鼠全基因组，长度4k

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2楼2017-04-17 16:12:55

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