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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR总是p不出来啊，大神们求助
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熙源羊羊羊

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR总是p不出来啊，大神们求助 已有5人参与

PCR总是p不出来，图中是体系跟程序，有时候配了4管一模一样的，只有一管有目的片段，后来再p一管也p不出来，稀释了模版十倍，20倍，，也没用，酶la taq..primer star  都试过，摸过梯度，现在一筹莫展。。

PCR总是p不出来啊，大神们求助


PCR总是p不出来啊，大神们求助-1


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1楼 2017-04-17 16:11:55
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匿名

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3楼2017-04-17 17:33:59
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shenshou167

新虫 (小有名气)
是不是仪器的原因？

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4楼2017-04-17 20:54:09
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shenshou167

新虫 (小有名气)
按道理一模一样，可能就是仪器的问题

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5楼2017-04-17 20:55:03
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-04-19 07:46:06
1. 首先要确定你的引物设计的没问题，因为基因组上突变不较多，如果引物太短很有可能影响扩增效率，可以适当加长引物长度，或者用兼并引物；
2. 保证基因组DNA提取的纯度，这个很重要，然后是完整度；
3. 如果做过退火梯度还不行，可以试一下touchdown PCR；
4. 考察一下这段基因组DNA的GC含量，如果太高，换用LA Taq的GC buffer
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6楼2017-04-18 10:23:40
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普通回帖

熙源羊羊羊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 熙源羊羊羊 at 2017-04-17 16:11:55
PCR总是p不出来，图中是体系跟程序，有时候配了4管一模一样的，只有一管有目的片段，后来再p一管也p不出来，稀释了模版十倍，20倍，，也没用，酶la taq..primer star  都试过，摸过梯度，现在一筹莫展。。


...

模板用的小鼠全基因组，长度4k

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2楼2017-04-17 16:12:55
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冰晶花

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试一下touch up pcr
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天马行空
7楼2017-04-18 16:44:05
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lvbolantao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-19 07:46:38
我是做微生物的，有个师妹各种p, p了一个学期没p出来，最后找到原因是老师给错菌株了，想提醒一下楼主，不要放过类似这种问题的排查
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活在当下
8楼2017-04-18 16:57:46
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海燕追梦

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-19 07:46:57
我之前是模板浓度太高，退火温度太高，你试试改变下条件

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9楼2017-04-18 21:11:57
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太阳的电子

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-19 07:47:17
4k是比较难扩出来的，配试剂时注意混匀。最好买专门pcr体系

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10楼2017-04-19 06:57:05
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