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小鼠脾组织冰冻切片 已有1人参与
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各位大神，总最近在做冰冻切片，可是做出来的片子看不到细胞结构，细胞很松散，求大神指点，这是小鼠脾的组织， |
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这是我的实验步骤， 气体麻醉机麻醉小鼠， 1.先用10ml的生理盐水（预先加热到37oC）；将老鼠，一般是30g，平放在冰块上，从下开始剪切，不能剪到内脏，破胸腔，将心脏暴露，用针尖（头皮针6号，针尖磨钝）小心地插入左心室（尖端靠右，剪破右心室，会有血流出），刚开始要快一点。，可以看到肝变白，还有肺， 2.用50ml的注射器吸10ml的PFA（平时4oC保存，要用时放入碎冰中），一共要注射3管(近30ml)。四肢抽搐，尾巴翘起来，第一管要快一点，但是太快血管会破裂，第二管稍微慢一点，第三管比第二管慢，然后再吸入空气，注射进老鼠体内。此时，四肢僵硬，肝硬肺白。整个灌注过程不到10min。 3．依次剪下老鼠的内脏，心肝脾肺肾和大脑，放入4%的PFA中，4oC保存24h-48h，固定。 沉糖 将内脏放入冰箱保存过夜，24h以上。再用10%，20%，30%的蔗糖溶液浸泡，每一个溶液都要从漂浮浸泡到沉底才可以换下一浓度溶液。第一个浓度大概1-2h，除了肺和心，然后20%的大概过夜，。30%的会好几天。其实在30%的时候不要这么久沉，但是有的时候来不及切片，就一直在4度冰箱30%的浓度保存。中间会换一次30%的蔗糖溶液。用的是pbs配。 然后切片时直接从蔗糖溶液中取出，用滤纸吸干，-20度包埋胶包埋，然后组织都是切大概6um，再片子放到-20度，需要时取出来染色，一般苏木素是20min，1%的盐酸酒精分化2-3s，然后伊红10s。再梯度脱水封片。结果染出来的片子不好看，考多空洞，看不到细胞结构，不知道哪一步骤除了问题，哪位大神指导一下。 |
2楼2017-04-10 19:43:54
3楼2017-04-11 08:24:55
4楼2017-04-11 20:17:15
hoyeung
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5楼2017-09-26 21:02:38