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请教用CCK-8做细胞毒性实验中的一些问题
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CCK-8是MTT升级版，CCk-8试剂盒只有一个溶液，里面的最主要的试剂就是WST-8，但是我想请教的是试剂里wst-8的浓度是多少？试剂里除了是、wst-8外还需要加加其他物质吗？ 我把网上找的cck-8的方法贴在这里，与大家分享。 Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的 formazan (参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细 胞数目呈线性关系。 图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂) WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒 体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的 formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶 解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵 敏度更高。 WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。 本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一 些药物诱导的细胞生长抑制检测。 本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同 位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解 formazan。可以用于大批量样品的检测。 酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。 WST-8对细胞无明显毒性。加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳 测定时间。 关于不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择，请参考http://www.beyotime.com/mtt-comp.htm。 本试剂盒可以测定500个样品。 装清单： 产品编号 产品名称 包装 C0038 CCK-8溶液 5ml — 说明书 1份 存条件： 4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存两年有效。 意事项： 由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸 发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方， 以缓解蒸发。 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设 法去除。 ¾ 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数 目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养并给予0-10微升特定的药物刺激。 2. 每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200微升，则需加入20微升CCK-8溶液，其它情况以此类推。可以用 加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加 了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。 3. 在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实 验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于 后续实验。 4. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为 参考波长进行双波长测定。 使用本产品的文献： 1. Hou G, Xue L, Lu Z, Fan T, Tian F, Xue Y. An activated mTOR/p70S6K signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma cell lines and inhibition of the pathway by rapamycin and siRNA against mTOR. Cancer Lett. 2007 Aug 18;253(2):236-48. 2. Ye CL, Jin YL, Zhou GX, Qin L. Effects of EGb761 on the antioxygen and cell apoptosis induced by H2O2 in RIN2m beta cells. Jou rna l of J inan U niversity(M edicine Edition). Aug.2007;V ol.28 No.4. 3. Zhu HL, Shen W, Chen ZY. Apoptosis of hepa tic stella te cells induced by sulfa salazine. Acta academiae medicnae mlitaris tertiae. Jan.2008;Vol.30,No.1. 4. Yang M, Zhou H. Grass carp transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta 1): molecular cloning, tissue distribution and immunobiological activity in teleost peripheral blood lymphocytes. Mol Immunol. 2008 Mar;45(6):1792-8. 5. Li XT, Zhang Y, Chen GQ. Nanofibrous polyhydroxyalkanoate matrices as cell growth supporting materials. Biomaterials. 2008 Sep;29(27):3720-8. 6. Lu J, Yue BH, Wang CM, Bai ST, Sheng GY. Efficacy of RNAi-induced down-regulation of wild-type FLT3 on NF-kB pathway in THP-1 cell line. Life Science Journal. Vol.5,No.2,2008. |
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