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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 重叠PCR 产物中的缺失了碱基
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卡拉

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助 重叠PCR 产物中的缺失了碱基

我用重叠PCR的方法 融合了两个基因  长度分别为45 和 1740  可测序回来以后长的那个基因缺失了 36个bp  其它位置完全正确  缺的位置又不是两个基因重叠的部分 是长基因的中间的位置  接下来我又做了几次  可测序结果都是缺那30几个bp  缺的位置起始位置相同 终止的位置有几个bp的浮动  缺的位置的碱基GC含量极为的高  将近90%  求大家 帮帮我  我都做了几个月了 总是缺那些碱基 我都要疯了  郁闷之极  有找不到办法解决   求求大家指点我一下  我在这里先谢谢大家了  要不这个年 就要在郁闷中度过了
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1楼 2008-12-27 23:53:37
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argnout

金虫 (小有名气)
会不会你摸版本身缺30个碱基

我以前作过多几十个碱基的
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2楼2008-12-28 14:37:00
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卡拉

新虫 (初入文坛)
模板是对的 我做之前是测过序的  我在想用GC buffer  不知道可以不? 那个基因本身的GC含量并不高  只是我缺的那段特别的 高  我是在不加引物的前提下 让他自身退火跑了10个循环  然后在加的引物  跑了25个循环  我都不知道 是哪步开始就缺了  真是郁闷啊
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3楼2008-12-28 21:36:35
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):鼓励交流 8-22 13:06
1. 长度为45的"基因"应该是pormoter吧？去掉重叠部分, 该"基因"不会超过30个Nt, 如此，这一部分可以考虑不用重叠PCR，而是直接合成到上游引物部分。
2.  1740 基因缺失部分36个bp GC含量将近90%，可能是在退火过程中自发形成hair-pin结构，导致PCR时被忽略掉，可考虑将此部位不对称拆分，进行重叠PCR。
3. 改用其它PCR酶体系，并添加DMSO，减少循环次数等。
Goodl uck！
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4楼2008-12-28 22:31:33
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卡拉

新虫 (初入文坛)
谢谢楼上的  45bp  的 也是一个基因  加上柔性LINKER 和酶切位点 就是80几个bp 了 我分析了  缺的哪几个bp  并没有形成发夹结构啊 ?
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5楼2008-12-28 23:26:11
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