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yaoyl0679金虫 (正式写手)
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[交流]
为何连接总是失败啊！
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想做一个克隆和表达，做了快半年了都没进展，现将实验过程描述一下，请高手指点迷津，也给后面的人做个参考： 基因片段1.6kb，设计了扩增引物，分别为启动子开始的前23个碱基和终止子之前22个碱基，在启动子前面和终止子后面加了两个酶切位点，启动子前为Nde1，终止子后面为Ecor I， 都根据保护碱基表加了保护碱基。 PCR扩增正常，PCR扩增后纯化产物用两种内切酶酶切四小时（试过同时切和先Nde再Ecor I，也试了酶切过夜），载体采用pet28，也同样酶切4h，酶切后PCR纯化试剂盒纯化，取纯化产物用takala的连接酶在16度（试过4度）连接8h（做过16h），然后转化感受态。 但是做了很多次，挑出来的菌落都是阴性的，即为载体。不知道为什么。很是郁闷，还请这方面的高手指教啊。 还有著名一下，酶切产物尤其试载体在酶切后凝胶电泳只有一个条带。 另外想问个问题，很多地方都说道，线型的质粒比超螺旋的快，但是为什么我每次提出来的质粒，在酶切后总比酶切前要跑的快，是不是正常啊。 |
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2楼2008-12-25 23:31:05
连接问题
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我在咨询师姐的过程中，发现连接过程中最关键的是载体的处理，也就是载体切的干不干净，我没有用过PET28a的，都是32a的，我一般都是酶切5h，也是takala的产品，多切一会儿没有关系的，另外，你的酶切体系多少？对于我用的酶切体系一般是50微升体系，其中酶切回收的用30微升去溶，然后全部上酶切，效果还不错，也可以在切胶回收的时候把2到3块胶放入一个柱中回收，这样浓度高。 连接过程是没有问题，16度过夜足够。 能长出菌落说明感受态也没有问题，除非感受态污染。 这样看来，我觉得还是你的载体出现问题了，建议你重做个载体。另外，切完后跑个电泳检测一下，和全质粒做个比较，虽然bp较短，但是多跑一些，我师姐说还是能看出差异来的，这就说明切开了。 好了，以上意见纯属个人言论，概不负责，但是绝对真实。 |
3楼2008-12-25 23:42:09
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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4楼2008-12-25 23:49:00
5楼2008-12-26 10:05:59
6楼2008-12-26 10:57:46
yaoyl0679
金虫 (正式写手)
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- 专业: 环境微生物学
7楼2008-12-26 11:46:49
