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请问蛋白跑完电泳割完胶，和上质谱之间还有什么操作哦？ 已有2人参与
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请问蛋白跑完电泳割完胶，和上质谱之间还有什么操作哦？怎么把胶溶了，怎么脱色，跪求详细一点的步骤，如果酶解的话一般常用什么酶？小白求教～ @hc-material @gyesang 发自小木虫IOS客户端 |
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robertno
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【答案】应助回帖
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将蛋白质点从银染的凝胶上挖出，放入硅化处理过的1.5 mL微量离心管中，用超纯水反复漂洗后，对该蛋白点进行胶内酶切。 ⑴脱色 在放有蛋白点的离心管中，加入50 µL脱色液（15 mmol/L K3Fe(CN)6溶于50 mmol/L Na2S2O3中），将蛋白点的棕色脱色至淡绿色，用超纯水漂洗以终止反应，直至蛋白点变为无色透明。然后将蛋白点所附着的丙烯酰胺切碎，用100 mmol/L NH4HCO3漂洗，并用100%乙腈（色谱纯）脱色至丙烯酰胺凝胶颜色变白，随后将其置于冷冻真空干燥器中进行冻干。 ⑵酶解 用pH 8.0的胰蛋白酶液（以50 mmol/L碳酸氢铵溶液为溶剂）将冻干的样品于37℃酶解过夜。每个蛋白点胰蛋白酶用量根据蛋白点大小，每个蛋白点约40~100 ng胰蛋白酶。 ⑶萃取 酶解后的肽段用60 µL 5% TFA和50%乙腈进行萃取，重复两次，每次15 min，合并萃取液并真空抽干。 ⑷样品复溶与脱盐 采用0.1% TFA溶液将干燥后的样品再次复溶，并用Zip TIP移液嘴脱盐。将1 µL除盐后的样品，置于质谱样品板上进行自然干燥，进行MALDI-TOF/TOF分析 这是我论文中的一部分……………… |
3楼2017-03-15 19:55:41
prthefu
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2楼2017-03-14 22:38:41
4楼2017-03-16 12:27:45