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glzeng

金虫 (小有名气)

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专业: 有机合成

[交流] 求助：活性测定,介绍一下哪里可以做该实验,谢谢！

实验目的：测定Test Sample相对Standard Sample的生物活性
实验方案：
1. 用一定量的Standard Sample对年龄为8-12周的雌性（SJLXBALB/C）F1鼠进行免疫；
2. 从免疫9-11天的小鼠体内提取初步培养的淋巴细胞；
3. 用一定量浓度为1-25 µg/ml 的Standard Sample对初步培养的淋巴细胞(一定数量)进行进一步培养，培养至少五个样品；
4. 用一定量的Test Sample样品对初步培养的淋巴细胞(一定数量)进行进一步培养，培养至少两个样品；
5. 第四和第五步中的细胞培养18-21h后，用ELISA测定由淋巴细胞分泌的IL-2的含量；
6. 比较用Standard Sample和Test Sample培养后淋巴细胞分泌IL-2的量。

如果Test Sample的活性相当于Standard Sample的80%-125%，则说明该Test Sample的活性已达到要求。

具体方法：
1. 免疫
制备Standard Sample溶液
准确称取15mg Standard Sample，溶解在无菌PBS中制备5mg/ml的溶液
制备GA乳状液
等体积Standard Sample溶液(5mg/ml)和CFA混合，形成稳定的乳状液注射：
将Standard Sample乳状液转移至胰岛素注射器，将100µL Standard Sample乳状液注射到小白鼠的四只脚掌(footpads)上(每只约25µL)。
2. 制备初级培养的淋巴（LN）细胞
初级培养的LN细胞的取自免疫9-11天的小白鼠。通过手术将LN转移至含有约5ml无菌RPMI medium的无菌培养皿中，LN细胞悬浮液用无菌注射器从培养皿转移至50ml 无菌试管。
细胞计数：
装有细胞悬浮液的无菌试管中加入RPMI medium至40ml，LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体重新分散在40 ml RPMI中，取两份体积50µL 的细胞悬浮液，分别加入150µL 0.1%锥虫蓝稀释四倍。将两份溶液用移入血球计的上下两个chamber中，混合物（细胞悬浊液和锥虫蓝）可在chamber中放置两分钟，活的细胞不能与锥虫蓝结合而呈现无色状态，死细胞则与锥虫蓝结合而显蓝色。计算细胞计数板中央方格中的活细胞数目，方格中边缘的细胞只有当细胞全部在方格中才计数，细胞密度通过下面的公式计算：
Average number viable cells(both chambles) ×4×104＝cells/ml
将LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体分散在DCCM1中,形成密度为1×107 cells/ml的溶液。

体外生物测定
体外生物测定在Flat-bottomed 细胞培养测试板上进行，最终体积为1ml
1. 制备Standard Sample校正曲线
1 mg/ml Standard Sample用DCCM1稀释至100 µg/ml(10倍)，用0.2 µ醋酸纤维素过滤，制备6个浓度为2-50 µg/ml的DCCM1和Standard Sample溶液。Standard Sample校正曲线的要求：线性回归曲线的R2≥0.97，斜率（β）≥0.77。
2. 制备稀浓度Test Sample溶液
准确称取10-20 mg Test Sample溶解在二次去离子水中制备1.2 mg/ml的溶液，光学密度（OD）在275 nm处测定。OD值调至1.03，制备1 mg/ml溶液，然后用DCCM1配成100 µg/ml溶液，用0.2µ醋酸纤维素过滤，该溶液稀释至10和20 µg/ml。

细胞培养：
下面这些溶液加入到24格细胞培养测试板
1. Standard Sample溶液
0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个Standard Sample稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：25，15，10，5，2.5，1 µg/ml。
2. Test Sample溶液
0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个Test Sample稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：5，10 µg/ml。

每个测试都包含如下控制：
1）负控制——用控制肽培养LN细胞
0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well）
0.5 ml MBP肽溶液（20 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为10 µg/ml）
2）正控制——用Con A（非特异性T细胞刺激剂）刺激LN细胞
0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well）
0.5 ml Con A（5 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为2.5 µg/ml）
细胞密度随着它们对GA的反应而发生变化。培养条件为37 ℃，湿度5％ CO2保温箱中18-21 h，测试板在室温下离心10 min（200×g），上清液转移至低温管中，在-20℃下可保存一星期。

用ELISA（酶联免疫吸附测定）检测白介素-2的含量(间接法)
所有样品测定次数为三次，每个plate都包含以下内容：
1）白介素-2标准曲线（要求：R2≥0.97）——包含至少6个非零浓度白介素-2
2）空白＋第一抗体，不含白介素-2标准品＋第二抗体（零点）
3） Standard Sample培养媒介、测试样品以及控制用DCCM1稀释，方法如下
a) 1, 2.5 µg/ml Standard Sample 样品以及反控制样品稀释2倍
b) 5-25 µg/ml Standard Sample样品和测试样品稀释5-10倍
c) 正控制样品(Con A)稀释15-20倍
测定白介素-2水平的ELISA方案按照制造商提供的方法进行，如果待测样品的OD值超过或低于Plate reader的极限值，则样品需重新配置后进行分析。

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1楼 2008-12-22 18:12:05

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