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glzeng金虫 (小有名气)
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[交流]
求助：活性测定,介绍一下哪里可以做该实验,谢谢！
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实验目的： 测定Test Sample相对Standard Sample的生物活性 实验方案： 1. 用一定量的Standard Sample对年龄为8-12周的雌性（SJLXBALB/C）F1鼠进行免疫； 2. 从免疫9-11天的小鼠体内提取初步培养的淋巴细胞； 3. 用一定量浓度为1-25 µg/ml 的Standard Sample对初步培养的淋巴细胞(一定数量)进行进一步培养，培养至少五个样品； 4. 用一定量的Test Sample样品对初步培养的淋巴细胞(一定数量)进行进一步培养，培养至少两个样品； 5. 第四和第五步中的细胞培养18-21h后，用ELISA测定由淋巴细胞分泌的IL-2的含量； 6. 比较用Standard Sample和Test Sample培养后淋巴细胞分泌IL-2的量。 如果Test Sample的活性相当于Standard Sample的80%-125%，则说明该Test Sample的活性已达到要求。 具体方法： 1. 免疫 制备Standard Sample溶液 准确称取15mg Standard Sample，溶解在无菌PBS中制备5mg/ml的溶液 制备GA乳状液 等体积Standard Sample溶液(5mg/ml)和CFA混合，形成稳定的乳状液注射： 将Standard Sample乳状液转移至胰岛素注射器，将100µL Standard Sample乳状液注射到小白鼠的四只脚掌(footpads)上(每只约25µL)。 2. 制备初级培养的淋巴（LN）细胞 初级培养的LN细胞的取自免疫9-11天的小白鼠。通过手术将LN转移至含有约5ml无菌RPMI medium的无菌培养皿中，LN细胞悬浮液用无菌注射器从培养皿转移至50ml 无菌试管。 细胞计数： 装有细胞悬浮液的无菌试管中加入RPMI medium至40ml，LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体重新分散在40 ml RPMI中，取两份体积50µL 的细胞悬浮液，分别加入150µL 0.1%锥虫蓝稀释四倍。将两份溶液用移入血球计的上下两个chamber中，混合物（细胞悬浊液和锥虫蓝）可在chamber中放置两分钟，活的细胞不能与锥虫蓝结合而呈现无色状态，死细胞则与锥虫蓝结合而显蓝色。计算细胞计数板中央方格中的活细胞数目，方格中边缘的细胞只有当细胞全部在方格中才计数，细胞密度通过下面的公式计算： Average number viable cells(both chambles) ×4×104＝cells/ml 将LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体分散在DCCM1中,形成密度为1×107 cells/ml的溶液。 体外生物测定 体外生物测定在Flat-bottomed 细胞培养测试板上进行，最终体积为1ml 1. 制备Standard Sample校正曲线 1 mg/ml Standard Sample用DCCM1稀释至100 µg/ml(10倍)，用0.2 µ醋酸纤维素过滤，制备6个浓度为2-50 µg/ml的DCCM1和Standard Sample溶液。Standard Sample校正曲线的要求：线性回归曲线的R2≥0.97，斜率（β）≥0.77。 2. 制备稀浓度Test Sample溶液 准确称取10-20 mg Test Sample溶解在二次去离子水中制备1.2 mg/ml的溶液，光学密度（OD）在275 nm处测定。OD值调至1.03，制备1 mg/ml溶液，然后用DCCM1配成100 µg/ml溶液，用0.2µ醋酸纤维素过滤，该溶液稀释至10和20 µg/ml。 细胞培养： 下面这些溶液加入到24格细胞培养测试板 1. Standard Sample溶液 0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个Standard Sample稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：25，15，10，5，2.5，1 µg/ml。 2. Test Sample溶液 0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个Test Sample稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：5，10 µg/ml。 每个测试都包含如下控制： 1） 负控制——用控制肽培养LN细胞 0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well） 0.5 ml MBP肽溶液（20 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为10 µg/ml） 2）正控制——用Con A（非特异性T细胞刺激剂）刺激LN细胞 0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well） 0.5 ml Con A（5 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为2.5 µg/ml） 细胞密度随着它们对GA的反应而发生变化。培养条件为37 ℃，湿度5％ CO2保温箱中18-21 h，测试板在室温下离心10 min（200×g），上清液转移至低温管中，在-20℃下可保存一星期。 用ELISA（酶联免疫吸附测定）检测白介素-2的含量(间接法) 所有样品测定次数为三次，每个plate都包含以下内容： 1） 白介素-2标准曲线（要求：R2≥0.97）——包含至少6个非零浓度白介素-2 2） 空白＋第一抗体，不含白介素-2标准品＋第二抗体（零点） 3） Standard Sample培养媒介、测试样品以及控制用DCCM1稀释，方法如下 a) 1, 2.5 µg/ml Standard Sample 样品以及反控制样品稀释2倍 b) 5-25 µg/ml Standard Sample样品和测试样品稀释5-10倍 c) 正控制样品(Con A)稀释15-20倍 测定白介素-2水平的ELISA方案按照制造商提供的方法进行，如果待测样品的OD值超过或低于Plate reader的极限值，则样品需重新配置后进行分析。 |
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