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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

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专业: 环境微生物学

[交流] 求助：关于同源重组目的基因的长度问题

做基因敲除时构建重组DNA时，部分目的基因＋抗性基因＋部分目的基因，那么部分目的基因的长度多少时同源重组率高？我看文献有几百BP的，有上千的，有的甚至刚一百BP.

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细推物理须行乐。

1楼 2008-12-19 19:40:48

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lauren180

木虫 (著名写手)

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基因打靶(gene targeting)技术，通过在转染细胞中发生的外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组(homologous recombination)，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
　　基因打靶的分子基础是，两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DNA分子之间发生的遗传信息的重组事件。这也就是说，基因打靶的一个基本条件是，在外源打靶基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。
　　基因打靶的基本过程包括如下几个步骤：
　　①首先是将要整合到受体细胞核基因组目标座位的外源打靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择性标记基因(例如 neo)的载体分子上，构成专用的基因打靶载体(gene targeting vector)；
　　②选用适当的核酸内切限制酶切割基因打靶载体，使之线性化后再用来转化受体细胞。由于外源打靶基因的两侧，与内源核基因组上的目标基因或座位之间存在着同源的DNA序列，因此当线性化的载体DNA被导入受体细胞之后，两者便会彼此配对；
　　③此时在重组酶RecBCD的作用下，两条同源DNA的相同部位便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现外源基因在核基因组DNA上的定点整合。
影响基因打靶效率因素：
　　基因打靶的效率取决于DNA同源重组的频率，它是与两条重组DNA分子之间的同源序列的长度密切相关的。基因打靶所需求的DNA同源性的有效长度为25bp。在哺乳动物细胞中，当DNA同源性的有效长度介于259～1800bp之间时，同源序列越长，基因打靶的效率也就越高。DNA同源性有效长度在2kb以上时，基因打靶的效率进一步提高，同源程度为14kb时，达到最高值；实验还观察到，当 DNA同源序列长度不到 200bp时，基因打靶的效率则会明显地下降。
　　生物体内的基因重组包括同源重组和非同源重组两种不同的类型。已发现在哺乳动物细胞中，也存在着类似于大肠杆菌重组酶RecA和RecBCD，而且在基因重组研究中还发现了一段能被RecBCD酶特异性识别的DNA序列，即chi位点。若在目标基因两侧加上chi位点，便可使重组效率提高50多倍，从而也就有效地提高了基因打靶的效率。
由于DNA分子的末端是重组酶的有效底物，所以使用线性化的基因打靶载体转染受体细胞，可以有效地提高基因打靶的效率。