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雌二醇检测实验 已有2人参与
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实验方法原理 采用标记有雌二醇单克隆抗体的胶体金颗粒与相对应的固定在硝酸纤维膜上的雌二醇结合物相结合，固定有雌二醇结合物的检测线处就显现明显的颜色。 实验材料 雌二醇抗体 试剂、试剂盒： 氯金酸、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗、雌二醇 仪器、耗材： 硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、分光光度计、低温高速离心机、点膜机 一、试剂与仪器 氯金酸；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗；雌二醇标准品、雌二醇单抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)。硝酸纤维膜、玻璃纤维膜；Beckman Du530分光光度计；低温高速离心机；点膜机。 二、 方法 1. 胶体金的制备 用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为01g/L,先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100 ml加入1%柠檬酸三钠25ml，再沸水浴下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10 min，冷却至室温后，用透射电镜镜检并用分光光度计检测颗粒均匀度及粒度。最后置于4℃冰箱保存备用。 2. 最适标记蛋白量的确定 用0.2mol/L K2CO3将胶体金溶液调至pH为8.2，然后取试管9支，分别加入10 ml胶体金溶液。将雌二醇抗体逐级稀释后，各取等体积稀释液顺序加入上述试管中，混匀，另设一不加抗体的对照管。放置10 min，在各管中加入0.1 ml的10% NaCl，混匀后静置2 h。观察各管中胶体金溶液变化，未加蛋白及加入量不足的溶液颜色由红变蓝，而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。标记蛋白量即为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量基础上再加20%。 3. 胶体金探针的标记 将抗体用0005mol NaCl溶液透析过夜，离心除去蛋白沉淀，调至05mg/ml。取胶体金100 ml，用0.2 mol/L K2CO3将胶体金溶液调至pH为9.0，磁力快速搅拌下缓慢加入24 ml稀释的雌二醇抗体，继续搅拌10 min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最终浓度为1%，再搅拌10 min。将初步制得的胶体金探针以4 000 r/mm离心20 min；弃沉淀，上清以10 000 r/min离心60 min；弃上清，沉淀用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(含1%牛血清白蛋白)重新悬浮；同前离心洗涤2次，将沉淀用0.1 mol/L的PBS(pH82，含1%BSA，002%NaN3)悬浮，4℃保存备用。 4. 抗原的合成 小分子物质难以固定在硝酸纤维膜上，只有使它连上大分子物质才能较好地固定。本实验采用混合酸酐法制备完全抗原。雌二醇-6-肟 43 mg，加入三正丁胺5 μl，二氧六环4 ml，冰浴冷却到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15 μl。4～10℃下反应30 min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10 mg，3ml水，3 ml二氧六环，1mol/L氢氧化钠03ml)。将配制好的OVA溶液加入反应液，4℃冰浴搅拌6h，反应过程中，用氢氧化钠维持pH值为8.反应完毕后，将反应液加入透析袋，透析2 d。将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现。离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存。将OVA溶于透析液内作为参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-OVA进行定性检验。经紫外测定证明蛋白质已与雌二醇衍生物结合。 5. 胶体金免疫层析试纸条制备 测试条由玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、加样纸、吸水纸4部分组成。将玻璃纤维膜裁成6mm的细条，然后放入含1% BSA、1%Tween-20的PB液中浸泡30 min，37℃烘干，最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上，真空干燥备用。在硝酸纤维膜上用点膜机将上述抗原和兔抗鼠IgG喷成2条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1% BSA、0.1mol/L PBS（pH9.0)封闭2 h，以0.1 mol/L PBS洗涤，再真空干燥。将30 mm吸水纸、25 mm硝酸纤维膜、6 mm玻璃纤维膜、15 mm加样纸，由顶部依次粘于PVC板上，裁成细条备用。 6. 检测与判读样品 含已知浓度雌二醇样品的乙醇溶液分为3组，第1组不加雌二醇，第2组为0.2 μg/ml雌二醇，第3组为0.4 μg/ml雌二醇。将加样纸一端插入待测液，湿润后取出，水平放置，约3～5 min，观察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅对照线呈一条紫红色带为阳性；如出现2条紫红色带为阴性；如质控线不出现紫红色带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。 |
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