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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 一步克隆法（同源重组）构建载体
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段开放

新虫 (初入文坛)

[求助] 一步克隆法（同源重组）构建载体 已有5人参与

使用一步克隆法（同源重组）构建载体，经测序验证构建的正确，然后在这个构建的载体基础上，用酶切连接的方法插入一个目的片段，经测序目的片段也正确的插入载体，但却发现目的片段一侧的载体序列却不正确。重复了好多次，一直找不到原因。
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1楼 2017-01-19 08:54:10
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梦想天行

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:51:18
设计和PCR没有问题的话,接口有问题的话，属于小概率的情况，也是可能出现的，多筛选几个测序，挑选正确的！

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2楼2017-01-20 06:47:07
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KGWD

至尊木虫 (文坛精英)
不懂啊

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3楼2017-01-20 07:29:23
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
额。。。为什么不用诺唯赞的多片段的重组试剂盒呢，一下就能连上2-5个片段，而且一步就能完成，哪还有后面那么多事啊，楼主可以尝试一下啊。。。
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
4楼2017-01-20 16:44:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能在接头处出点问题，挑选正确的克隆就是了。如果不影响使用，出现差异也无所谓。
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5楼2017-01-21 21:53:04
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烟雨莫问

金虫 (小有名气)
建议对原始载体进行测序。

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6楼2017-01-22 11:42:15
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hch123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你做的什么基因啊，有些基因不稳地，是会出现体内缺失的。可以尝试更换低拷贝的感受态。
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脚踏实地：遇一个，学一个，会一个。。。
7楼2017-01-22 12:48:53
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小静儿000

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是不是载体插入位点附近的碱基与同源臂的同源性太高，导致重组出错。
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8楼2017-01-22 15:58:05
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sun美萍

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2017-01-20 16:44:10
额。。。为什么不用诺唯赞的多片段的重组试剂盒呢，一下就能连上2-5个片段，而且一步就能完成，哪还有后面那么多事啊，楼主可以尝试一下啊。。。

如果有重复区域怎么办？
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9楼2019-06-23 17:12:54
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