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段开放

新虫 (初入文坛)

[求助] 一步克隆法(同源重组)构建载体 已有5人参与

使用一步克隆法(同源重组)构建载体,经测序验证构建的正确,然后在这个构建的载体基础上,用酶切连接的方法插入一个目的片段,经测序目的片段也正确的插入载体,但却发现目的片段一侧的载体序列却不正确。重复了好多次,一直找不到原因。
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梦想天行

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:51:18
设计和PCR没有问题的话,接口有问题的话,属于小概率的情况,也是可能出现的,多筛选几个测序,挑选正确的!

发自小木虫Android客户端
2楼2017-01-20 06:47:07
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KGWD

至尊木虫 (文坛精英)

3楼2017-01-20 07:29:23
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
额。。。为什么不用诺唯赞的多片段的重组试剂盒呢,一下就能连上2-5个片段,而且一步就能完成,哪还有后面那么多事啊,楼主可以尝试一下啊。。。
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
4楼2017-01-20 16:44:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能在接头处出点问题,挑选正确的克隆就是了。如果不影响使用,出现差异也无所谓。
5楼2017-01-21 21:53:04
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烟雨莫问

金虫 (小有名气)

建议对原始载体进行测序。

发自小木虫Android客户端
6楼2017-01-22 11:42:15
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hch123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你做的什么基因啊,有些基因不稳地,是会出现体内缺失的。可以尝试更换低拷贝的感受态。
脚踏实地:遇一个,学一个,会一个。。。
7楼2017-01-22 12:48:53
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小静儿000

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是不是载体插入位点附近的碱基与同源臂的同源性太高,导致重组出错。
8楼2017-01-22 15:58:05
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sun美萍

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2017-01-20 16:44:10
额。。。为什么不用诺唯赞的多片段的重组试剂盒呢,一下就能连上2-5个片段,而且一步就能完成,哪还有后面那么多事啊,楼主可以尝试一下啊。。。

如果有重复区域怎么办?
9楼2019-06-23 17:12:54
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